трации 2,5 г/100 мл. Добавьте бромциан (0,5 г/мл в диоксане) до конечной концентрации 25 мг/мл.

4. Активация должна происходить в течение 6 мин при комнатной температуре. Поддерживайте рН 11,0, добавляя 10 ? КОН.

5. Быстро профильтруйте активированную целлюлозу и промойте ее 100 объемами холодной воды, затем 100 объемами холодного 50%-ного. ДМСО и, наконец, 50 объемами 100%-ного ДМСО при комнатной температуре.

6. Ресуспендируйте целлюлозу в концентрации 0,1 г/мл в ДМСО' и добавьте ?-аминофенилмеркурацетат до концентрации 20 мМ (используя 1 ? раствор этого реагента в ДМСО). Перемешивайте суспензию в течение ночи при комнатной тепературе.

7. Профильтруйте Hg-целлюлозу. Ресуспендируйте ее в 0,4 ? 2-амино-2-ме-тил-1,3-пропандиоле, растворенном в ДМСО, и перемешивайте в течение ночи при комнатной температуре.

8. Промойте Hg-целлюлозу 100 объемами 50%-ного ДМСО и затем 100 объемами воды. Храните при 4 °С в 0,01%-но-м азиде натрия.

4.3.3. Использование ?-тионуклеозидтрифосфатов

[y-S]-ATP и [y-S]-GTP с успехом применялись для изучения транскрипции в ядрах различных клеток: миеломы мыши [26, 27], дрожжевых [28], Xenopus [29], Physarum [30] и клеток мыши, инфицированных вирусом ?[24]. Однако примеси РНКазы в неочищенных препаратах ядер могут вызывать сильную деградацию ядерной РНК, что приведет к артефактам в исследованиях инициации, поскольку образующиеся при этом фрагменты РНК со свободными 5'-гидроксильными группами могут метиться [?-S]-нуклеотидами, действующими как доноры фосфата для эндогенной полинуклеотидкиназы [31]. В таких случаях вместо [y-SJ-рибуноклеозидтрифосфатов можно использовать [?-S]-рибонуклеозидтрифосфаты [32, 33], поскольку последние не являются субстратами для полинуклеотидкиназы [34]. Однако другие стороны синтеза РНК (в частности, кэпирование) еще не изучали с использованием [?-S] -нуклеотидов. Более того, не ясно, в какой степени способны различные эукариотические РНК-полимеразы использовать [?-S]-нуклеотиды в качестве

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

131

субстратов. Наконец, в отличие от [?-S]-нуклеотидов (разд. 4.3.2) ? [?-S]-нуклеотиды еще не поступают в продажу, и поэтому их приходится синтезировать в лаборатории [32, 33].

4.3.4. Кэпирование РНК in vitro

Кэпирование транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II in vivo, в норме происходит вскоре после инициации синтеза РНК. Существует несколько структур кэпа. Их можно классифицировать в соответствии с числом молекул рибозы, которые метилируются в структуре mGpppXpYpZpN... Структура кэп 0 (в природе обнаруживаемая в дрожжах) не содержит О-метильных групп. Структура кэп I (О-метилированная рибо-за только в Х-нуклеозиде) и структуры кэп II (О-метилированая рибоза содержится и вХ-, и в ?-нуклеозидах) находятся в мРНК млекопитающих. Первая реакция О-метилирования идет в ядре и структуры кэп I обнаруживаются в гяРНК, а вторая реакция О-метилирования, возможно, проходит в цитоплазме, поскольку структуры кэп II не обнаруживаются в гяРНК. При образовании кэпа два фосфата происходят из а- и ?-фосфатов включившегося первым рибонуклеозидтрифосфата и один — из «-фосфата GTP, используемого в реакции кэпирования. После образования кэпа гуанозин метилируется в положении 7. Помимо мРНК структуры кэп II содержат также малые ядерные РНК млекопитающих (типа U). В этом случае гуанозин метилируется дважды по 2-аминогруппе, а также в положении 7 с образованием 2,2,7-триметилгуанозина.

Если в качестве предшественника используют [ct-32P]-GTP, то кэпы, образующиеся in vitro, будут мечеными. Кэп можно также пометить с помощью АТР, GTP, UTP или СТР, содержащих [32Р] в ?-положении. В последнем случае метка в кэпе происходит от первого нуклеотида в цепи РНК- Поэтому включение ?-фосфата из меченого GTP в кэп синтезированной in vitro РНК свидетельствует о том, что РНК была кэпирована in vitro, а включение [?-32?] -нуклеозидтрифосфата в кэп in vitro означает, что транскрипция была инициирована in vitro. Таким образом, хотя формально кэпирование является посттранскрипционной модификацией, здесь мы рассматриваем его как потенциальный тест на инициацию синтеза РНК in vitro. При использовании любого радиоактивного предшественника необходимо отделить большое количество нуклеотидов, включенных в РНК во время элонгации, от кэпа, чтобы последний можно было проанализировать. Сделать это можно методом, описанным в табл. 12. Согласно этому методу, РНК гид-ролизуют РНКазами Т1 и Т2 с последующей хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Так можно разделить струк-

9*

132

Глава 4

Таблица 12. Выявление кэпов в РНК: метод А [35]

1. Проинкубируйте ядра в системе транскрипции in vitro, как описано в табл. 5, добавив в реакционную смесь S-аденозилметионин в конечной концентрации 20 мкМ. В качестве меченого радиоактивного предшественника используйте [a-32P]-GTP, [р-32Р]-нуклеозидтрифосфат или [3Н]5-адено-зилметионин (500 мкКи/мл).

2. Выделите РНК, как описано в табл. 6.

3. Растворите РНК в 50 мкл 50 мМ трис-HCl, рН 7,5.

4. Добавьте по 10 ед. РНКазы Т1 и РНКазы Т2 (Sigma) и проинкубируйте при 37 °С 3 ч. Продуктами этого гидролиза будут мононуклеотиды, олиго-нуклеотиды с 2'-0-метилированными остатками рибозы и набор кэп-струк-тур (разд. 4.3.4).

5. Добавьте 100 мкг РНК-носителя (например, рРНК или тРНК), гидролн-зованного панкреатической РНКазой (10 мкг, 37 °С, 1 ч).

6. Смешайте продукты гидролиза РНК с 1 мл 7,0 ? мочевины, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, и нанесите смесь на колонку (0,6x30,0 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной этим буфером. Проведите элюцию с колонки градиентом NaCl 0—0,35 ? (в общем объеме 100 мл) в этом же буфере. Непрерывно регистрируйте А254 элюата и собирайте фракции по 2 мл для определения их радиоактивности по Черен-кову. УФ-поглощение обусловлено гидролизатом РНК-носителя (п. 5) и показывает место выхода в процессе элюции различных по размеру оли-гонуклеотидов. Разделение происходит по величине заряда (рис. 3). Радиоактивность, элюируемая с тринуклеотидами и олигонуклеотидами большего размера, может соответствовать кэп-структуре в РНК, синтезированной in vitro; структуры кэп 0 элюируются с тринуклеотидами, структуры кэп I — с тетрануклеотидами и структуры кэп II —с пентануклеотидами (рис. 3).

7. Объедините колоночные фракции, элюированные при заряде от —4 до —7.

8. Разбавьте объединенные фракции тремя объемами воды. Нанесите пробы на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, приготовленную в пастеровской пипетке и предварительно уравновешенную водой.

9. Промойте колонку четырьмя объемами воды, чтобы удалить соли и мочевину, и затем элюируйте нуклеотиды минимальным объемом 2,0 ? бикарбоната триэтиламмония, рН 7,5.

10. Элюат лиофильно высушите.

11. Растворите остаток нуклеотидов в 200 мкл воды.

12. Повторяйте пп. 10 и 11, пока не будет удален весь бикарбонат триэтиламмония (3—4 раза).

13. Чтобы подтвердить наличие кэпов, обработайте олигонуклеотиды нуклеазой Р1 и щелочной фосфатазой (Sigma). Для этого растворите лиофи-лизованные нуклеотиды в 10 мкл 10 мМ ацетата натрия, рН 5,8, добавьте 5 мкг нуклеазы Р1 и инкубируйте при 37 °С 1 ч. Затем доведите рН смеси до рН 7,0 — 8,0, пользуясь 1 ? трис-HCl, рН 9,0, и добавьте щелочную фосфатазу до конечной концентрации 2 мкг/мл. В процессе инкубации при 37 °С в течение 3 ч все кэп-структуры превращаются в структуры кэп I (разд. 4.3.4), а олигонуклеотиды — в нуклеозиды и неорганический фосфат.

14. Отделите кэпы от нуклеозидов методом тонкослойного электрофореза на пластинке с целлюлозой (20x20 см, Kodak Ltd) при 200 В в течение 3 ч в 5%-ной уксусной кислоте, 0,5%-ном пиридине, 1 мМ ЭДТА. Электрофорез проводите до тех пор, пока маркер ксиленцианол не мигрирует на 9—10 см. Другой вариант отделения осуществляют с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на ???-целлюлозе в 0,5 ? КН2Р04, доведенном до рН 3,5 фосфорной кислотой. В этом случае продолжайте

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

133

хроматографию до тех пор, пока буфер не достигнет верха пластинки. Подходящие кэп-маркеры (P-L Biochemicals) детектируются при УФ-ос-вещении после электрофореза или хроматографии.

15. Поскольку существуют кэпирующие нуклеотиды двух типов (7-метилгуа-нозин в мРНК [8] и 2,2,7-триметилгуанозин в мяРНК [8]), необходимо их разделить. Элюируйте кэпы с пластинки с тонким слоем целлюлозы (после электрофореза в п. 14) водой или с пластинки с ???-целлюлозой (после хроматографии в п. 14) 2М бикарбонатом триэтиламмония, рН 7,5.

16. Лиофилизуйте элюированный материал.

17. Растворите кэпы в 5 мкл 10 мМ ацетата натрия, рН 5,0, и добавьте 10 ед. кислой пирофосфатазы табака (BRL). Инкубируйте пробы при 37 °С 2 ч.

18. Лиофилизуйте и растворите в 1—2 мкл дистиллированной воды.

19. Отделите 7-метилгуанозинмонофосфат от 2,2,7-триметилгуанозинмонофос-фата методом двумерной тонкослойной хроматографии. Нанесите гидро-лизат на пластинку с тонким слоем целлюлозы (20x20 см; Kodak Ltd) и проведите хроматографию в смеси изомасляная кислота : аммиак : вода (66: 1 :33) в первом направлении и в смеси 0,1 ? натрийфосфатный буфер, рН 6,8 : сульфат аммония : пропан-1-ол (100:60:2, объем/вес/'объ-ем) во втором направлении [37]. В качестве маркеров при хроматографии используйте четыре рибонуклеозид-5'-монофосфата и 7-метилгуанозинмонофосфат (P-L Biochemicals).

На рис. 3 показано типичное разделение.

Таблица 13. Выявление кэпов в РНК: метод Б [36]

1. Проинкубируйте ядра в системе для транскрипции in vitro, как описано в табл. 5, добавив в реакционную смесь S-аденозилметионин в конечной концентрации 20 мкМ. В качестве радиоактивного предшественника внесите 500 мкКи [a-32P]-GTP, [р-32Р]-нуклеозидтрифосфата или [3Н]5-адено-зилметионина.

2. Выделите РНК методом, описанным в табл. 6.

3. Растворите РНК в 10 мкл 0,1 ? смеси муравьиная кислота — пиридин, рН 6,0, и добавьте 10 мкг нуклеазы Р1. Проинкубируйте при 37 °С 3 ч.

4. Высушите пробу и растворите ее в 10 мкл 0,1 ? бикарбоната аммония, рН 8,0, добавьте 0,5 ед. щелочной фосфатазы (Worthington) и проинкубируйте при 37 °С 1 ч.