5. Высушите гидролизат под вакуумом. Растворите остаток в небольшом объеме воды и снова высушите. Повторите эту операцию 2—3 раза, чтобы удалить все следы бикарбоната аммония.

6. Растворите нуклеотиды в минимальном объеме воды и нанесите раствор на предварительно увлажненные полоски ацетатцеллюлозы. Используйте в качестве маркеров ксиленцианол (синий) и кислый фуксин (розовый). Проводите электрофорез при 2000—3000 В в смеси: 5%-ная уксусная кислота— 0,5%-ный пиридин — 5 ? мочевина, рН 3,5, до тех пор, пока кислый фуксин не пройдет 20—25 см. Затем перенесите полоску прямо на пластинку с ???-целлюлозой (20x20 см). Расположите полоску таким образом, чтобы ее начало пришлось на один край ???-пластинки, а кислый фуксин выходил за ее пределы на другом.

7. Проводите хроматографию на ???-пластинке в смеси 1,3 ? муравьиная кислота — пиридин, рН 4,2, до тех пор, пока фронт буфера не достигнет верха пластинки.

8. Высушите пластинку и экспонируйте ее с рентгеновской пленкой, используя усиливающий экран Dupont Lightning-Plus. Идентифицируйте кэпы с помощью соответствующих маркеров (P-L Biochemicals).

9. Элюируйте кэпы 2,0 ? бикарбонатом триэтиламмония, рН 7,5, и проанализируйте их согласно пп. 16—19 табл. 12.

134

Глава 4

32Р, имгг •мин"1 ·10"3

30

Фракции

32Р, имп/мин

Рис. 3. Кэпирование РНК in vitro. А. РНК была синтезирована в ядрах in vitro в присутствии [32P]-GTP (табл. 5), гидролизована РНКазами Т1 и Т2 и нанесена на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой в 7,0 ? мочевине (табл. 12, пп. 1—6). РНК была гидролизована панкреатической РНКазой, и гидролизат служил источником маркеров заряда. Олигонуклеотиды элюировали градиентом 0—0,35 ? NaCl в 7 ? мочевине, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5. Положение олигонуклеотидов определенного размера (указанное стрелкой и числом, обозначающим их суммарный заряд) детектировали путем непрерывной регистрации поглощения элюата при 254 нм. Элюат собирали в виде фракций и радиоактивность каждой фракции определяли по Черенкову. Поскольку 98% элюированной радиоактивности находится в виде мононуклео-тидов, масштаб, начиная с определенной точки графика, пришлось изменить. Светлые кружки и штриховая линия соответствуют [32Р] в имп/мин-10-3, а темные кружки и сплошная линия — [32Р] в имп/мин. Б. Колоночные фракции, относящиеся к материалу, элюируемому в области зарядов —4, —5, —6 и —7, были объединены, обессолены и обработаны нуклеазой Р1, а затем щелочной фосфатазой (табл. 12, пп. 7—13). Нуклеотиды были разделены методом тонкослойного электрофореза при рН 3,5 (табл. 12, п. 14). GMP (pG), обнаруживаемый в пробах, может происходить из О-метилгуанозина в структурах кэп I и кэп II или из неполного гидролизата исходной РНК. Дорожка 1 — продукты гидролиза, элюируемые с зарядом —4; дорожка 2 — продукты гидролиза, элюируемые с зарядом —5; дорожка 3 — продукты гидролиза, элюируемые с зарядом —6 и —7. В. Кэп-структуры (mGpppA), выявленные на хроматограмме рис. Б, элюировали водой, гидролизовали кислой фосфатазой табака и гидролизат разделяли методом двумерной тонкослойной хроматографии, как описано в табл. 12 (пп. 15—19). Пятно X, вероятно, является 2,2,7-триметилгуанозинмонофосфатом. Указаны положения маркеров AMP (рА), GMP (pG), CMP (рС) и UMP (pU), определенных при освещении ультрафиолетом, а также положение маркера 7-CH3-G.MP(mpG). Клонированные ДНК любезно предоставлены д-ром Хо

и д-ром Стаффордом.

136

Глава 4

туры кэп 0, кэп I и кэп II, образующиеся при РНКазном гидролизе [GpppXp, GpppX(m)pYp, GpppX(m)pY(m)pZp соответственно]. Однако во фракцию кэпов в виде примесей могут попасть внутренние фрагменты РНК, имеющие О-метильные группы [например, X(m)pY(m)pZp], или не до конца гидроли-зованная РНК. Поэтому материал, элюируемый с ДЭАЭ-цел-люлозы с зарядами от —4 до —7, гидролизуют нуклеазой Р1 и щелочной фосфатазой, в результате чего получают «сердцевину» кэпа (GpppXoH), которую затем характеризуют с помощью гидролиза нуклеотидпирофосфатазой (Sigma) или кислой пи-рофосфатазой табака (BRL) с последующим разделением мо-нонуклеотидов двумерной тонкослойной хроматографией. На рис. 3 приведен типичный анализ кэпирования РНК in vitro в соответствии с описанной выше методикой.

Другой подход [36] позволяет обнаруживать «сердцевину» кэпа одноэтапным методом (табл. 13). В соответствии с ним РНК, синтезированную in vitro, гидролизуют нуклеазой Р1 и образующиеся нуклеотиды разделяют электрофорезом на ацетат-целлюлозе с последующей хроматографией на ???-цел-люлозе. Большая часть метки, включенной в РНК, при гидролизе оказывается во фракции монофосфатов, и кэпы (GpppX(m)p) можно обнаружить и идентифицировать с помощью маркеров (например, фирмы P-L Biochemicals).

С помощью этого метода [36] было убедительно показано включение [?-32?]-??? и [p-32PJ-GTP в кэпы РНК SV40 во время транскрипции в изолированных ядрах.

В целом после транскрипции в ядрах кэпируется приблизительно 10% транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II [35].

5. Анализ специфических РНК-транскриптов

5.1. Очистка РНК-транскриптов

Одна из главных трудностей, встречающихся при использовании изолированных ядер как системы транскрипции, состоит в отделении РНК, транскрибированной in vitro, от эндогенной РНК, имеющейся в ядрах в большом избытке (правда, специфические РНК-транскрипты можно идентифицировать с помощью гибридизации нуклеиновых кислот). В частности, желательно отделить цепи РНК, инициированные in vitro, от цепей, которые были просто элонгированы. Для решения этой задачи было разработано несколько методик, позволяющих физически отделить РНК, транскрибированную in vitro, от эндогенной РНК. Такое разделение полезно при двух условиях: а) когда

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

137

анализируют меченый ДНК-зонд, а не меченую РНК, например при картировании с помощью нуклеазы S1 (гл. 5, разд. 5.2); б) когда гибридизации мешают большие количества эндогенной РНК, например в случае рРНК или мяРНК-

В исследованиях транскрипции на изолированном хроматине с использованием экзогенной РНК-полимеразы основная сложность связана с возможностью РНК-зависимого синтеза РНК (гл. 5). Но такой синтез не идет в изолированных ядрах, в которых для транскрипции используется эндогенная РНК-полимераза, и поэтому любые выделенные в данном случае РНК-транскрипты должны быть продуктами транскрипции аутентичного гена. Тем не менее всегда следует проверять, что наблюдаемое включение — это результат транскрипции, применяя ?-аманитин (для РНК-полимераз II и III) (разд. 3.2) или акти-номицин D (25 мкг/мл) для РНК-полимеразы I.

5.1.1. Использование меркурированных нуклеозидтрифосфатов

Показано [37], что 5-меркурированный UTP (Hg-UTP) можно использовать в качестве субстрата для синтеза РНК РНК-полимеразой Escherichia coli. Поскольку РНК, содержащая ртуть (Hg-PHK), подобно другим ртутьорганическим производным, обладает высоким сродством к меркаптанам, фракционирование на аффинной колонке с агарозой, содержащей сульфгидрильные группы (например, Bio-Rad Affi-Gel 501), позволяет отделить новосинтезированную Hg-PHK от эндогенной РНК.

Условия транскрипции in vitro с использованием Hg-UTP аналогичны условиям, описанным в табл. 5, за исключением того, что в первом случае в состав буфера для хранения ядер входит 12 мМ 2-меркаптоэтанол вместо ДТТ (табл. 1). После синтеза новообразованную Hg-PHK прогревают и затем хрома-тографируют на тиолированной сефарозе (табл. 6, гл. 5) при 55—60 °С. Повышенная температура необходима для достижения оптимального отделения Hg-PHK от эндогенной РНК- Этот метод обладает рядом недостатков. При использовании в качестве субстрата Hg-UTP, даже если Hg-группа блокирована 2-меркаптоэтанолом, скорость синтеза РНК в ядрах уменьшается на 30—35%, а длина цепи Hg-PHK короче по сравнению с РНК. не содержащей замещенных нуклеотидов [37]. Тем не менее мы использовали этот метод, чтобы показать, что в ядрах, выделенных из клеток миеломы, сохраняются характерные особенности регуляции синтеза мРНК, кодирующей легкую ?-цепь иммуноглобулина. В ядрах клеточной линии 66.2 миеломы мыши, продуцирующей ?-цепь, in vitro траскрибируется РНК, содержащая 0,02% мРНК для ?-цепи. Ядра клеточной линии МОРС 315, продуцирующей легкие ?-цепи, синтезируют

138

Глава 4

менее 0,0008% мРНК ?-цегш. В дальнейшем этот метод с успехом использовали при анализе транскрипции глобиновых [38], овальбуминовых [39] и вирусных генов [40].

5.1.2. Использование а-тионуклеозидтрифосфатов

В последнее время при исследовании транскрипции, если требовалось отделить новосинтезированную РНК от эндогенной РНК, мы использовали вместо Hg-UTP [?-S]-рибонуклеозидтрифосфаты [26]. Условия транскрипции in vitro в этом случае были аналогичны условиям, описанным в табл. 5. Скорость синтеза серусодержащей РНК в ядрах миеломы линейно зависит от времени на протяжении по крайней мере 1 ч, и, как показывает электрофорез в геле в денатурирующих условиях, РНК, транскрибированная в присутствии 5 мкМ [a-35S]-ATP, идентична РНК, транскрибированной в присутствии 5 мкМ АТР плюс [а-32Р]-нуклеотиды. [a-35S]-ATP можно использовать как единственный меченый предшественник для получения [a-35S]-PHK или в сочетании с [a-32P]-GTP для получения [32Р]-РНК, содержащей серу.

Новосинтезированную серусодержащую РНК (a-S-PHK) отделяют от эндогенной РНК с помощью аффинной хроматографии на ртутьорганическом носителе типа Hg-целлюлозы или Hg-агарозы. Приготовление таких носителей описано выше в этой главе (разд. 4.3.2). Выделение y-S-PHK методом хроматографии на Hg-целлюлозе или Hg-агарозе описано в табл. 10, Б. Однако, в отличие от y-S-PHK (табл. 10, Б), a-S-PHK плохо связывается с Hg-целлюлозой при рН 7,9 и гораздо лучше при рН 4,9. Поэтому разделение проводят в буфере, имеющем следующий состав: ОД ? NaCl, 40 мМ ЭДТА, 0,1%-ный ДСН, 50 мМ ацетат натрия, рН 4,9. Чтобы при этом рН разделение было эффективным, содержание ртути в Hg-целлюлозе не должно превышать 10 мкмолей Hg/r целлюлозы, поскольку при более высоком содержании ртути имеет место значительное неспецифическое связывание. Требование