ежа гибридизовалп с нанесенной на фильтр ДНК, представляющей собой одну половину гена N1. После расщепления РНКазой Т1 длина РНК уменьшилась до половины в соответствии с размером комплементарного фрагмента ДНК- Этот метод очень помогает в следующем случае. Известно, что клонированные кДНК связывают новообразованные РНК, содержащие вставочные последовательности, но при обработке РНКазой вставочные последовательности деградируют, и при этом образуются фрагменты РНК, имеющие размеры

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

143

Таблица 15. Элюция гибридизовавшейся РНК с иммобилизованной ДНК

А. Стандартный метод

1. Если нитроцеллюлозный фильтр уже использовали раньше для счета радиоактивности в жидком сцинтилляторе (табл. 14, п. 20), то сначала промойте его хлороформом.

2. Высушите каждый фильтр на воздухе и затем поместите его в микроцентрифужную пробирку. Добавьте 75 мкл 98%-ного формамида (деионизо-ванного)1, 0,2%-ного ДСН и дрожжевой тРНК2 (10 мкг/мл).

3. Инкубируйте фильтры при 60 °С 10 мин и затем отберите раствор, содержащий элюированную РНК.

4. Элюируйте фильтры еще один раз согласно пп. 2 и 3 и объедините оба

элюата.

5. К объединенным элюатам добавьте 0,2 мл 0,6 ? NaCl и затем 1,0 мл абсолютного этанола. Оставьте раствор при —70 °С на 30 мин.

6. Отцентрифугируйте при 10 000g 10 мин при 4 °С, чтобы осадить РНК-Б. Элюция после расщепления РНКазой TP

1. Если необходимо, удалите с фильтра загрязнения сцинтилляционной жидкостью согласно п. 1 разд. А (выше).

2. Каждый высушенный фильтр проинкубируйте в 100 мкл 50 мМ ацетата натрия, рН 5,5, содержащего 10 ед. РНКазы Т1, при 37 °С 10 мин.

3. Промойте каждый фильтр три раза 100 мкл 0,1%-ного ДСН, 2XSSC4 (по 10 мин) для инактивации остатков РНКазы Т1.

4. Элюируйте устойчивую к РНКазе РНК, как описано в пп. 2—6 разд. А (выше).

1 Формамид деионизуйте, как описано в сноске 2 табл. 14.

2 По-другому РНК можно элюировать, прогревая каждый фильтр в 100 мкл раствора дрожжевой тРНК в воде (10 мкг/мл) при 100 °С 2 мин. При обоих вариантах элюции получают почти идентичные результаты.

3 РНКазу А нельзя использовать вместо РНКазы T1, поскольку она не полностью инактивируется при промывке.

4 См. табл. 14, сноска 1.

экзонов, из которых состоит кДНК. Таким образом, анализ РНК-транскриптов с обработкой РНКазой Т1 или без нее дает информацию как относительно размеров новообразованного РНК-транскрипта, так и относительно размеров экзонов в соответствующем гене.

5.3.2. Определение размеров перед гибридизацией

Методика Шиблера и др. [42] позволяет гибридизовать фракции агарозного геля непосредственно с ДНК-дотами (табл. 16). РНК фракционируют в 0,8%-ном агарозном геле при денатурирующих условиях с формальдегидом [43], глиоксалем [17] или метилртутьгидроксидом [44]. Затем гель разрезают на небольшие кусочки и каждый кусочек растворяют в 0,6 ? перхлорате натрия. Раствор наносят прямо на фильтры, содержащие иммобилизованную клонированную ДНК, и количество гибридизующегося материала измеряют стандартным методом. Это позволяет точно определять размеры транскрип-

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 5. Определение размеров РНК-транскриптов. ДНК-зондом служила плазмида, содержащая ген для малой ядерной N1 РНК морского ежа [6] с длиной 163 нуклеотида. Рестриктаза Aval разрезает ген в положении 116, а рестриктаза Hinfl — в положении 87. Плазмиды, содержащие интактный ген или ген, расщепленный ферментами Aval или Hinfl, были иммобилизованы на нитроцеллюлозе. Фильтры инкубировали с [32Р]-РНК, транскрибированной in vitro в ядрах морского ежа. С каждой плазмидной ДНК-зондом было проанализировано по два фильтра. С одного из этих фильтров РНК элюировали сразу, а другой фильтр перед элюцией РНК обрабатывали РНКазой Т1. Элюированную РНК проанализировали методом электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в 7,0 ? мочевине. Дорожка 1 — необработанная РНК, элюированная с нерасщепленной Nl-ДНК; дорожка 2 — РНК, которая была связана с Nl-ДНК, расщепленной Hinfl, и обработана перед элюцией РНКазой Т1; дорожка 3 — РНК, которая была связана с Nl-ДНК, расщепленной Hinfl и элюирована без предварительной обработки РНКазой; дорожка 4 —РНК, которая была связана с Nl-ДНК, расщепленной Aval, и обработана РНКазой Т1 перед элюцией; дорожка 5 — РНК, которая была связана с Nl-ДНК, расщепленной Aval, и элюирована без предварительной РНКазной обработки; дорожка 6 —то же, что дорожка 1; дорожка 7 —РНК, которая была связана с нерасщепленной Nl-ДНК, но затем перед элюцией обработана РНКазой Т1. В /зЬ/?-гидролизате (дорожка 2) есть полосы, соответствующие 5'-концевой части (90 нуклеотидов) и З'-концевой части (75 нуклеотидов). В Лиа1-гидролизате (дорожка 4) видны две полосы, соответствующие фрагментам приблизительно по 120 нуклеотидов; оба они относятся к 5'-концевой части последовательности. Наличие двух полос может быть связано с гетерогенностью разрезания РНКазой Т1. З'-концевой фрагмент уже вышел из геля.

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

145

Таблица 16. Определение размеров РНК перед гибридизацией [42]

Этот метод заключается во фракционировании РНК методом электрофореза в денатурирующих условиях при использовании метилртутьгидроксида с последующей гибридизацией элюатов из кусочков геля для локализации исследуемой РНК-Внимание: метилртутьгидроксид чрезвычайно токсичен, и поэтому все этапы,, на которых применяется этот реагент, должны проводиться в вытяжном шкафу с хорошей тягой.

1. Приготовьте 1%-ный агарозный гель в 7,5 мМ метилртутьгидроксиде,. 50 мМ борной кислоте, 10 мМ сульфате натрия, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3. Проведите электрофорез радиоактивной РНК, используя буфер приведенного выше состава (но без метилртутьгидроксида), как описано в работе [44].

2. После электрофореза разрежьте гель на кусочки размером 1—2 мм. Растворите каждый кусочек в небольшом объеме раствора: 2 ? перхлорат натрия, 0,1%-ный ДСН, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 4-кратный раствор Денхардта1, 0,25 мг/мл дрожжевой тРНК, 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, и инкубируйте пробы при 68 °С 2 ч.

3. Отберите по аликвоте из каждой пробы и определите ее суммарную радиоактивность на сцинтилляционном счетчике.

4. Приготовьте нитроцеллюлозные фильтры (Schleicher and Schuell, ВА85, диаметром 0,9 см), на каждом из которых было заранее иммобилизовано (табл. 14) по 5 мкг ДНК-зонда для изучаемой РНК. Поместите один фильтр в каждую пробу РНК и покройте раствор слоем парафинового масла. Гибридизуйте при 65 °С 18 ч.

5. После гибридизации промойте фильтры при 68 °С 1 ч раствором, в состав которого входят: 2 ? перхлорат натрия, 0,1%-ный ДСН, 20 мМ трис-HCl, рН 7,4, затем промойте раствором 0,1%-ного ДСН+2х55С2 при 68 °С 1 ч и затем раствором 2XSSC при комнатной температуре 1 ч. Каждый раз используйте 10 мл промывочного буфера на 1 фильтр.

6. Промойте фильтры раствором 0,lxSSC при комнатной температуре 15 мин. В другом варианте можно обработать фильтры РНКазой для снижения фонового связывания РНК с фильтром согласно табл. 14, п. 17.

7. Оцените количество гибридизовавшейся меченой РНК по радиоактивности, измеренной на сцинтилляционном счетчике (табл. 14, п. 19).

1 Состав раствора Денхардта приводится в сноске 3 к табл. 14.

2 См. табл. 14, сноска 1.

тов, содержащих специфические последовательности. Данный метод предпочтительно применять при анализе больших РНК-транскриптов.

5.4. Определение концов РНК-транскриптов

При изучении синтеза РНК in vitro важно ответить на вопросы, являются ли места начала и окончания синтеза РНК in vitro уникальными и как они связаны с сайтами инициации и терминации синтеза РНК in vivo. Ответы на эти вопросы можно получить, пользуясь методами, описанными ниже. Для этого из клонированной геномной ДНК выделяют специфические субклонированные фрагменты, содержащие 5'- или З'-ко-нец гена, переносят их на нитроцеллюлозу, гибридизуют с мечеными РНК-транскриптами и гибриды обрабатывают РНКазой

10—953

146

Глава 4

, 2 3 4 1 2 3 4

Рис. 6. Концы РНК-транскриптов генов рРНК в ядрах зародышей морского ежа. А. Ядра, выделенные из зародышей Lytechinus variegatus на стадии бластулы, инкубировали с [a-32P]-GTP. Меченую РНК гибридизовали с клонированной ДНК, содержащей 500 bp с 5'-конца гена рРНК или 500 bp с 3'-конца гена рРНК. В параллельном эксперименте РНК, меченную in vivo 32Р04, гибридизовали с такими же ДНК. Гибриды обрабатывали РНКазой Т1, после чего РНК элюировали и анализировали с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле. Указаны положения маркеров 7S-PHK (300 нуклеотидов) и 5S-PHK (120 нуклеотидов). Дорожка 1—синтезированная in vitro РНК, гибридизованная с 5'-фрагментом гена; дорожка 2 — синтезированная in vivo РНК, гибридизованная с 5'-фрагментом гена; дорожка 3 — синтезированная in vitro РНК, гибридизованная с З'-фрагментом гена; дорожка 4 — синтезированная in vivo РНК, гибридизованная с З'-фрагментом гена. ;В случае 5'-фрагмента имеются несколько полос (д. 2). Неизвестно, обусловлено ли это гетерогенностью разрезания РНКазой Т1 или наличием различных •сайтов инициации. Точно так же неизвестно происхождение дуплета на до-,рожке 3. Б. РНК, синтезированную in vitro, гибридизовали с разделенными цепями ДНК, клонированной в колифаге М13. Гибриды обрабатывали РНКазой Т1 и анализировали или в 6%-ном полиакриламидном геле (дорожки 1 и 2), или в 10%-ном полиакриламидном геле (дорожки 3 и 4). В каждом случае указано положение маркера 7S-PHK (300 нуклеотидов). На дорожки 1—4 наносили пробы с РНК, которую гибридизовали соответственно с 5'-концом некодирующей цепи, 5'-концом кодирующей цепи, З'-кон-цом кодирующей цепи и З'-концом некодирующей цепи.

Т1 Затем РНК элюируют и анализируют путем электрофореза -в геле Если выбраны небольшие клонированные фрагменты, то защищенные РНК-фрагменты малы, даже если они входили ¦в большие транскрипты, и их размеры могут быть определены точно При известной последовательности ДНК можно опреде-

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

147'

лить концы РНК, транскрибированной in vitro. Пример таког