о анализа для генов рРНК Lytechinus variegatus приведен на. рис. 6. На рис. 6, А сравниваются концы рРНК, синтезированной в изолированных ядрах зародышей на стадии бластулы, с концами РНК, синтезированной in vivo. На рис. 6, Б показано, что РНК, синтезируемая in vitro, копируется только со смысловой цепи ДНК. Фрагменты, соответствующие 5'- или З'-об-ластям гена, были субклонированы в колифаге М13. Различные ДНК (четыре клона, каждый из которых содержал одну цепь одного из концов) гибридизовали с РНК-транскриптами и затем определяли длину связавшейся РНК- Следует отметить, что это позволяет также определить уровень транскрипции в 5'- и З'-областях и таким образом оценить количество законченных цепей РНК, которые метятся преимущественно по З'-концу в отличие от транскрипции de novo, при которой метятся оба конца. В приведенном примере (рис. 6) 300 нуклеотидов на 5'-конце транскрипта размером 8 kb метятся довольно сильно. Это заставляет предполагать, что имеет место инициация синтеза РНК-

6. Применение систем ядерной транскрипции

Транскрипция в изолированных ядрах — один из лучших методов, позволяющих ответить на ряд важных вопросов. До сих пор наиболее плодотворными были эксперименты, в которых определяли относительные скорости транскрипции гена и структуру первичного транскрипта. Систему транскрипции в изолированных ядрах можно использовать также для выявления регуляторных факторов и факторов, необходимых для процессинга РНК.

6.1. Измерение относительной скорости транскрипции гена

Относительную скорость транскрипции данного гена (относительно транскрипции других генов) можно определить путем измерения количества РНК (синтезированной in vitro), гнбри-дизующейся с избытком ДНК (дот-гибридизация; табл. 14), и сравнивая эту величину с общим количеством синтезированной РНК- В целом 5 мкг ДНК на один дот (табл. 14) обеспечивает значительный избыток ДНК для количественной гибридизации, если только имеют дело не со структурной РНК (например, рРНК или мяРНК). Преимущество данного метода заключается в том, что получаемые данные не искажаются из-за деградации РНК в изолированных ядрах. Однако делается допущение, что скорость транскрипции всех генов in vitro отра-

Ю*

148

Глава 4

Таблица 17. Относительная скорость транскрипции гистонового гена

Изолированные ядра

Ядра, выделенные из клеток миеломы мыши в экспоненциальной фазе роста или из клеток, обработанных цитозинарабинозидом (ага-С; 40 мкг/мл), инкубировали с [32P]-GTP в условиях транскрипции in vitro (табл. 5). Меченую РНК (6,4· 106 имп/мин) каждой партии ядер гибридизовали с дотами различных ДНК-зондов1, иммобилизованных на нитроцеллюлозных фильтрах (табл. 14), и количество РНК, связывающееся с каждым дотом, определяли по радиоактивности, измеряемой на сцинтилляционном счетчике.

ЛЯЛИ 11U ра/х,«^«1ч -----' ДНК-зонд1

Источник РпгК Н3.2 Н2а

.Контрольные клетки (имп/мин) Включение, % г . ,

Клетки, обработанные ага-С (имп/

/мин)

Часть от контроля, 7о

1265 1007 680 30

0 020 0,016 0,012 0,0005

226 149 624 25

21,0 14,8 91,8 —

Кгегки меченные in vivo импульсной меткой

Источник РНК

ДНК-зонд'

Н3.2

Н2а

PBR322

Контрольные клетки (имп/мин) Включение, % „ . ,

Клетки, обработанные ага-С (имп/

./мин)

Часть от контроля, %

1137 976 2244 40

0 016 0,014 0,032 0,0006

200 170 1847 35

17,6 17,4 85,0 —

роль). ________'---'

жает активность in vivo. Не исключено, что это неверно для малых транскриптов, которые могут неэффективно инициироваться, в то время как большие транскрипты элонгируются после инициации in vivo. В таком случае большие транскрипты будут составлять большую долю РНК, меченой in vitro, по сравнению с их долей после импульсного мечения in vivo. Чтобы скомпенсировать это, транскрипцию следует проводить в течение короткого времени (5 мин), когда большая часть транскрипции должна отражать элонгацию уже инициированных РНК, и сравнивать результаты с транскрипцией при более длительных периодах инкубации (30 или 60 мин), когда различия л эффективности инициации разных генов должны быть более

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

149

выраженными. Относительные скорости транскрипции гена измеряют для каждого периода времени. Если относительные скорости транскрипции не зависят от продолжительности инкубации, то измеряемая скорость, вероятно, является точным отражением скорости транскрипции in vivo. В табл. 17 [45] показано применение этого метода для измерения изменений, происходящих при транскрипции гистонового гена. Относительные скорости транскрипции in vitro хорошо согласуются с соответствующими скоростями in vivo, определяемыми путем импульсного мечения клеток в течение 5 мин [3Н]-уридином (табл. 17). В этом опыте доля РНК, приходящаяся на гисто-новую мРНК, не зависит от длительности периода транскрипции, несмотря на то, что эти транскрипты содержат лишь 500 нуклеотидов. Отсюда следует, что гистоновые гены либо эффективно инициируются in vitro, либо определенное число молекул РНК-полимеразы II уже ассоциировано с этими генами in vivo и они начинают транскрипцию в разные моменты во время инкубации in vitro.

6.2. Что такое первичный транскрипт

Благодаря низкому уровню деградации РНК в системе с ядрами, выделенными из клеток многих типов, существует возможность выявлять первичные транскрипты, которые из-за быстрого процессинга РНК, особенно по З'-концу, трудно обнаружить in vivo. Однако in vitro терминация не всегда идет правильно. Чтобы показать, что транскрипты, наблюдаемые in vitro, существуют и in vivo, ядра клеток, экспрессирующих глобиновые гены, метили в течение 1 мин i[32P]-GTP [46, 47]. Затем РНК-транскрипты гибридизовали с фрагментом геномной ДНК, локализованным на расстоянии 1 kb от З'-конца глобино-вого гена в направлении транскрипции. Поскольку РНК-полимераза II способна транскрибировать in vitro только со скоростью 300 нуклеотидов/мин '[18], любая меченая РНК, комплементарная области, выходящей за пределы 500 оснований от З'-конца гена, должна относиться к транскриптам, инициированным in vivo и распространившимся в эту область in vitro. По-видимому, первичный глобиновый транскрипт продолжается за пределы последнего экзона глобиновой мРНК З'-Об-ласть первичного транскрипта можно определить, используя 1-минутный период мечения для транскрипции in vitro на изолированных ядрах и применяя соответствующие зонды для З'-конца гена. Четко показать, что эти З'-последовательности транскрибируются in vivo, не удалось, по-видимому, из-за того, что они быстро деградируют [47].

150

Глава 4

6.3. Выделение и изучение первичных транскриптов

В этом разделе описан метод выделения первичных РНК-транскриптов после их инициации в присутствии [?-S]-рибонуклеозидтрифосфата. Его можно использовать для идентификации и выделения транскриптов, начинающихся с определенного нуклеотида. Выделенные транскрипты можно секвенировать и выявить точные сайты инициации в пределах клонированного фрагмента ДНК.

Транскрипцию проводят, инкубируя ядра в условиях, описанных в табл. 5 или 10, используя в качестве меченого нукле-озидтрифосфата [y-S5S]-ATP или [y-35S]-GTP (New England Nuclear). Включение [y-3SS]-нуклеотида в 5'-конец РНК-транскрипта можно показать способом, описанным в сноске 2 к табл. 10. [у-35Э]-РНК-транскрипты гибридизуют с соответствующей изучаемому гену клонированной ДНК-зондом, которая нанесена на нитроцеллюлозный фильтр (табл. 14). После гибридизации связавшуюся РНК элюируют (табл. 15) и расщепляют ферментами по специфическим основаниям (подробности метода см. в разд. 7 ссылки [48]). 5'-[Y-35S]-Cvniroiiy-клеотиды отделяют от олигонуклеотидов, образовавшихся при расщеплении по внутренним сайтам, методом электрофореза в полиакриламидном геле, приготовленном с использованием ?-акриламидофенилртути в качестве мономера [41]. Серусо-держащие 5'-олигонуклеотиды связываются с меркурированным гелем, в то время как олигонуклеотиды, образовавшиеся при разрезании по внутренним сайтам, мигрируют через него. Связавшиеся олигонуклеотиды можно элюировать с геля, если продолжить электрофорез в буфере, содержащем отрицательно заряженное тиольное соединение. Эти олигонуклеотиды содержат последовательность [3SS]-pppXp, но имеют разную длину в зависимости от локализации расщепляемой связи. Поэтому после электрофореза образуется набор из фрагментов разной длины («лестница»), которые выявляют с помощью радиоавтографии. Последовательность РНК на 5'-конце транскрипта определяют по этой «лестнице», как делают при использовании ДНК-секвенирующих гелей. В действительности этот метод эффективен даже без элиминации внутренних олигонуклеотидов, поскольку они не мечены и не обнаруживаются на радиоавтографах. Поэтому можно определить последовательность на 5'-конце .первичного транскрипта простым анализом продуктов ферментативного расщепления (см. выше) на обычном секвенирующем геле [48]. Сравнивая эту последовательность РНК с последовательностью гена, с которого получены транскрипты, можно точно картировать сайты начала транскрипции при инициации in vitro.

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

151

Чтобы продемонстрировать эффективность у-тионуклеотидов как индикаторов инициации, мы выделили синтезированные in vitro РНК-транскрипты, кодируемые ДНК фага ЯСЬг. Тран-скрппты, начинающиеся с А или G, были отобраны с использованием соответственно [y-S]-ATP или [y-S]-GTP [49]. При замене АТР или GTP на соответствующие у-тнонуклеотиды относительная эффективность транскрипции не изменялась и ошибки считывания не выявлялись [49]. Такой же принцип можно использовать для выделения РНК-транскриптов, специфически начинающихся с А или G при синтезе в изолированных ядрах. Кроме того, поскольку сейчас имеются пиримидиновые аналоги [y-S]-UTP и [y-S]-CTP, с их помощью можно проверить, могут ли эукариотические РНК-полимеразы использовать пиримидиновые нуклеотиды для инициации синтеза цепей РНК вместо АТР или GTP.

6.4. Изучение посттранскрипционных модификаци