й

Ядра, выделенные из культивируемых клеток по методу, описанному в разд. 2.2, не способны осуществлять процессинг, полиаденилирование и метилирование РНК, но их можно использовать для получения первичных транскриптов, не имеющих кэпов. Таким образом, эта система представляет собой как бы исходную точку для воссоздания процесса созревания

рнк.

6.4.1. Полиаденилирование

В изолированных ядрах идет лишь слабое полиаденилирование транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II, которое можно усилить, добавив клеточный или ядерный экстракты [50]. Получение подходящих экстрактов описано в табл. 18.

Транскрипцию проводят обычным способом в присутствии [a-32P]-GTP (табл. 5), добавляя в каждую реакционную смесь 80 мкл клеточного или ядерного экстракта. Концентрации солей и других компонентов доводят до значений, соответствующих стандартной реакционной смеси для транскрипции (табл. 5, п. 1). После транскрипции РНК выделяют обычным способом (табл. 6) и затем полиаденилированные транскрипты идентифицируют методом хроматографии на poly (и)-сефарозе с элю-цией градиентом формамида [50] (табл. 19). Poly (и)-сефароза позволяет разделять РНК по длинам их poly (А)-участков, в то время как oligo (dT)-целлюлоза связывает все полиаденилированные РНК одинаково независимо от длины poly (А). Таким образом, хроматография на poly (U)-сефарозе дает возможность различать настоящие poly(A)+-PHK от РНК, содержа-

152

Глава 4

Таблица 18. Приготовление экстрактов для посттранскрипционной модификации

Получение клеточных экстрактов^ 2

1. Отцентрифугируйте клетки (500g, 5 мин, 25 °С) и промойте их два раза 0,14 ? NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5.

2. Промойте клетки один раз пятью объемами раствора: 25 мМ КО, 2 мМ ацетат магния, 1 мМ ДТТ, 10 мМ трнс-НО, рН 7,5.

3. Ресуспендируйте осадок клеток в одном объеме этого буфера (обычно ресуспендируют 5-Ю8 клеток в 1 мл буфера) и дайте клеткам набухнуть в течение о мин при 4°С.

4. Лизируйте клетки путем гомогенизации (10 движениями пестика типа «В» в гомогенизаторе Даунса).

5. Доведите концентрацию КО в гомогенате до 0,35 М, пользуясь 4,0 ? КС1.

6. Отцентрифугируйте гомогенат при 10 000g 5 мин, чтобы осадить ядра и митохондрии.

7. Отберите супернатант и отцентрифугируйте его при 100 000g 1 ч при 4 °С.

8. Отберите супернатант и храните его маленькими порциями в жидком азоте. Эти экстракты стабильны минимум 3 мес.

Получение ядерных экстрактов1-2

1. Приготовьте клеточный гомогент, как описано выше (пп. 1—4).

2. Отцентрифугируйте гомогенат при 1000g 3 мин при 4 °С, чтобы осадить ядра.

3. Гомогенизируйте неочищенные ядра в 1 мл 0,35 ? КО, 2 мМ ацетата магния, 1 мМ ДТТ, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5. Повышенная концентрация соли вызывает лизис ядер.

4. Приготовьте ядерный экстракт с помощью центрифугирования, как описано в пп. 6—8 первой части этой таблицы. Этот неочищенный ядерный экстракт содержит всю полчаденилирующую и метилирующую активности клеточных экстрактов и не содержит цитоплазматических белков и РНК.

1 Эндогенные РНК можно удалить путем пропускания свежеприготовленного экстракта через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (объемом 3 мл), уравновешенную 0,3 ? КС1, 2 мМ ацетатом натрия, 1 мМ ДТТ, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5. Элюцию с колонки проводят этим же буфером н собирают фракции, содержащие белок, который ие задерживается колонкой.

2 Если требуется, малые молекулы (рибонуклеозидтрифосфаты и соли) можно удалить с помощью хроматографии экстракта на колонке с сефадексом G25 (объемом 10 мл), уравновешенной 10%-ным глицеролом, 0,12 ? K.C1, 5 мМ ацетатом магния, 1 мМ ДТТ, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5. Фракции, соответствующие свободному объему, объединяют и хранят в жидком азоте. Если экстракт не хроматографируют на сефадексе G25, то в нем остается значительное количество рибонуклеозидтрифосфатов, которые снижают удельную активность меченого радиоактивного нуклеозидтрифосфата в последующих экспериментах.

щих случайные полиаденозиновые участки, закодированные в геноме.

Для определения размеров poly (А)-последовательностей по-лиаденилированных РНК-транскриптов транскрипцию in vitro проводят, используя в качестве предшественника [3Н]-АТР или [а32Р]-АТР, и длину poly (А) определяют непосредственно путем электрофореза в геле после расщепления остальной части РНК РНКазами А и Т1 (табл. 20).

Наконец, за синтезом poly (А)-последовательности in vitro можно следить, измеряя отношение [3Н]-аденозина к [3Н]-АМР после гидролиза щелочью [50] (табл. 21). Этим способом

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

153

Таблица 19. Выделение полиаденилированной РНК методом хроматографии на poly (и)-сефарозе

1. Растворите пробу РНК (выделенную согласно табл. 6) в буфере для нанесения (0,4 ? NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5%-ный ДСН, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5). Прогрейте при 80 °С 2 мин, чтобы денатурировать РНК, и затем охладите во льду.

'2. Нанесите пробу на колонку с poly(и)-сефарозой (объем 1 мл), предварительно уравновешенную буфером для нанесения, при комнатной температуре и соберите несвязавшуюся РНК.

3. Вновь нанесите несвязавшуюся РНК на колонку, как в п. 2. Повторите такое нанесение в общей сложности три раза, добиваясь полного связывания полиаденилированной РНК. Обычно только ~10% общей включившейся радиоактивности связывается с колонкой.

¦4. Промывайте колонку буфером для нанесения до тех пор, пока РНК не перестанет выходить с колонки (следите по радиоактивности). Затем проведите элюцию с колонки 5%-ным (по объему) формамидом в буфере для элюции (1 мМ ЭДТА, 0,5%-ный ДСН, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5). При этом выйдет слабо связавшаяся РНК, содержащая лишь короткие участки oligo(A).

5. Проведите элюцию 10 мл линейного градиента (5—60%) формамида в буфере для элюции. Соберите фракции по 0,5 мл. Полиаденилированная РНК, содержащая 3'-ро1у(А) размером около 200 остатков, элюируется во фракциях 11—15.

•6. Наконец, проведите элюцию 90%-ным формамидом в буфере для элюции. В этой фракции должно элюироваться меньше 0,1% сорбированной радиоактивности.

7. Вновь уравновесьте колонку буфером для нанесения, чтобы подготовить ее к повторному использованию.

Таблица 20. Определение длины poly (А)-последовательностей

,1. Инкубируйте ядра в системе транскрипции in vitro, как описано в табл. 5, используя в качестве предшественника 1 мКи/мл [3Н]-АТР или [гх-32Р]-АТР и добавив в инкубационную смесь 80 мкл клеточного или ядерного экстракта. Общая концентрация АТР должна быть 100 мкМ. Концентрацию остальных компонентов доведите до стандартных концентраций обычной транскрипционной смеси (табл. 5, п. 1).

'2. Выделите РНК способом, описанным в табл. 6, и затем очистите поли-аденилированную РНК методом аффинной хроматографии на poly(U)-ce-фарозе (табл. 19).

3. Соберите фракции, содержащие полиаденилированные РНК-транскрипты. Добавьте 40 мкг тРНК-носителя, NaCl до концентрации 0,3 ? и затем 2,5 объема этанола. Оставьте РНК осаждаться при 20 °С в течение ночи.

4. Осадите РНК центрифугированием (10 000g 15 мин) и затем растворите ее в 50 мкл 0,4 ? NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5. Добавьте 0,1 мг РНКазы А и 1 ед. РНКазы Т1 и инкубируйте при 25 °С 30 мин. При этом гидролизу-ются все последовательности РНК, кроме poly (А)-последовательностей, не подвергающихся гидролизу при высоких концентрациях соли.

5. Проведите хроматографию гидролизата РНК на ро1у(и)-сефарозе и выделите радиоактивную poly (А) (табл. 19).

6. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя к радиоактивной poly (A), NaCl до концентрации 0,3 ? и затем 2,5 объема этанола и оставьте смесь на ночь при —20 °С, чтобы poly (А) выпала в осадок.

154

Глава 4

7. Отцентрифугируйте poly (А) при lOOOOg 15 мин.

8. Определите размеры радиоактивной poly (А) методом электрофореза в полиакриламидном геле (табл. 8). Удобными маркерами в данном случае являются мяРНК клеток млекопитающих.

Таблица 21. Анализ ро1у(А) методом щелочного гидролиза

1. После транскрипции (табл. 5) выделите полиаденилированные РНК-транскрипты методом аффинной хроматографии на ро1у(и)-сефарозе (табл. 19) и обработайте их РНКазами А и Т1 (табл. 20, пп. 1—4), чтобы отделить радиоактивную poly (А).

2. Высушите пробу под вакуумом и растворите ее в 25 мкл 0,3 ? КОН. Внесите раствор в стеклянный капилляр, запаяйте его и инкубируйте при 37 °С 18 ч.

3. Перенесите гкдролизованную poly(A) в микроцентрифужную пробирку, разломив капилляр. Доведите рН раствора до нейтрального, добавляя 3 ? хлорную кислоту, и затем отцентрифугируйте в микроцентрифуге 10 мин, чтобы осадить выпавший перхлорат калия.

4. Высушите супернатант под вакуумом и затем растворите остаток в 20 мкл воды, содержащей 100 мкг аденозина.

5. Нанесите пробу на полоску бумаги Whatman № 1. Проводите хроматографию 18 ч при комнатной температуре, используя в качестве растворителя смесь 1-бутанол : 0,1 ? хлорид аммония (6: 1, по объему).

6. Отметьте положение маркера аденозина при освещении УФ-еветом.

7. Разрежьте хроматограмму на полоски (шириной 1 см) и элюируйте отдельно каждую полоску небольшим объемом 0,3 ? NaOH. Нейтрализуйте каждую фракцию, добавляя 3 ? уксусную кислоту, и определите радиоактивность фракций на сцинтилляционном счетчике, используя смесь тритон Х-100 — толуол — омнифлуор1. AMP остается на старте, а аденозин мигрирует на 10—20 см.

1 13 г омнифлуора (NEN), 2 л толуола, 1 л тритона Х-100.

отличают действительный синтез от обмена концевых звеньев poly (А). Отношение [3Н]-АМР к [3Н]-аденозину должно быть равно длине poly (А)-последовательности. В случае же обмена концевых звеньев poly (А) или наращивания ранее имевшейся poly (А) отношение [3Н]-АМР к [3Н]-аденозину будет гораздо ниже, чем длина poly (А).

6.4.2. Метилирование

Активность, ответственную за метилирование РНК в изолированных ядрах, можно восстановить [35] добавлением того же клеточного экстракта, который восстанавливает полиаденнли-рующую активность (разд. 6.4.1). За метилированием РНК следят по метке, используя в качестве меченого радиоактивного предшественника [3Н] СНз-Э-аденозилметионин (табл. 22). Метилированные основания идентифицируют посл