е гидролиза РНК РНКазой Т1, нуклеазой Р1 и щелочной фосфатазой с последующим электрофорезом и хроматографией в тонком слое. Ме-

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

155

Таблица 22. Метилирование РНК-транскриптов

1. Проинкубируйте ядра, как описано в табл. 5, используя в качестве радиоактивного предшественника [3Н]СН3-5-аденозилметионин в концентрации 10 мкМ с удельной радиоактивностью минимум 10 Ки/мМ. В каждую пробу добавьте 80 мкл клеточного экстракта, полученного согласно табл. 18. Остальные компоненты возьмите в той же концентрации, что и в стандартной реакционной смеси для транскрипции (табл. 5, п. 1).

2. Выделите РНК-транскрипты способом, описанным в табл. 6. В РНК включается только 20—30% [3Н]СН3-5-аденозилметионина. Остальная радиоактивность включается в ДНК. и белок.

3. Обработайте метилированную РНК РНКазами Т1 и Т2 и фракционируйте олигонуклеотиды хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе в 7 ? мочевине (табл. 12, пп. 3—6).

4. Соберите элюированные олигонуклеотиды, затем обессольте пробу и обработайте ее нуклеазой Р1 и щелочной фосфатазой (табл. 12, пп. 8—13).

5. Проведите анализ нуклеозидов методом тонкослойной хроматографии, чтобы идентифицировать метилированные основания [36].

тилирование идет на продуктах транскрипции, синтезируемых всеми тремя эукариотическими РНК-полимеразами. Происходит также интенсивное метилирование эндогенных предшественников ? РНК, но метилирование предшественников тРНК и мРНК наблюдается преимущественно на молекулах РНК, синтезированных in vitro [35].

6.4.3. Кэпирование молекул — предшественников мРНК

Анализ кэпирования первичных РНК-транскриптов, синтезированных in vitro, описан в разд. 4.3.4. Шаткин и др. [51] установили, что мРНК реовируса начинаются с GTP и растущие цепи в присутствии S-аденозилметионина сразу же кэпируются с образованием метилированной 5'-концевой кэп-структуры m7GpppGm. При соответствующих условиях образование кэпа может также происходить после транскрипции, что позволяет предположить, что активности полимеразы и ферментов кэпирования не являются тесно сопряженными. Пытаясь выделить первичные продукты перед процессингом, мы исследовали синтез РНК реовируса с помощью вирусных «коровых» ферментов, используя в качестве субстратов тионуклеотиды. В присутствии [?-32?] [y-S]-GTP как маркера инициации первичные транскрипты реовирусной мРНК были синтезированы in vivo «ко-ровым» ферментом, находящимся в препарате вируса [23]. Многие транскрипты содержали трифосфорилированные 5'-кон-цы, которые не были кэпированы. Более того, фосфогидролаза, связанная с вирионом, гидролизовала GTP в GDP, но не могла гидролизовать [y-S]-GTP. Таким образом было показано, что кэпирование является посттранскрипционным процессом. Поскольку ?-тиофосфатная группа кислотонеустойчива, ее можно

156

Глава 4

Транскрипция РНК в изолированных ядрах

157

удалить слабой кислотой, например 7%-ной муравьиной [23], без разрыва фосфодиэфириой связи в РНК. Это позволяет изучать реакцию кэпирования, используя РНК, инициированную in vitro.

6.4.4. Сплайсинг молекул предшественников мРНК

Анализ сплайсинга (образования зрелых молекул мРНК) первичных транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II, in vitro в изолированных ядрах клеток млекопитающих не дал удовлетворительных результатов. Есть сообщения [52, 53], что аденовирусная РНК подвергается сплайсингу в препарате неочищенных ядер клеток HeLa, но насколько эффективно идет этот процесс, не установлено. Тем не менее не исключено, что ядра клеток млекопитающих могут оказаться полезными в приготовлении субстратов для сплайсинга и обнаружении продуктов сплайсинга с помощью гибридизации, как описано выше. Преимущество системы, содержащей целые ядра, заключается в том, что РНК в ней находится в нативной конформации в комплексе с соответствующими белками.

6.4.5. Процессинг предшественников тРНК

Изолированные ядра способны к синтезу молекул-предшественников тРНК, но не способны поддерживать их процессинг с образованием зрелой тРНК [2]. Отсутствующая активность ферментов, обеспечивающих процессинг, не восстанавливается при добавлении клеточных экстрактов, приготовленных в 0,35 ? КС1 (табл. 18) и способных восстановить полиаденили-рование (разд. 6.4.1) и метилирование (разд. 6.4.2). Однако эту активность можно восстановить добавлением экстрактов, приготовленных из неочищенных ядер в 0,15 ? КС1 [2]. За про-цессингом предшественников тРНК с превращением в зрелую тРНК удобнее всего следить с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле (табл. 8).

6.4.6. Процессинг предшественников рРНК

К моменту написания книги не было никаких данных об успешном процессинге предшественников эукариотической рРНК в бесклеточной системе.

6.5. Изучение ядерного транспорта зрелой РНК

Для исследования РНК, вышедшей из ядер, реакционную смесь для транскрипции (табл. 5) разбавляют одним объемом раствора: 0,1 ? КС1, 5 мМ ацетат магния, 10 мМ трис-HCl,

рН 7,5, наслаивают поверх равного объема буфера для хране-1 ния с глицеролом (табл. 1) и центрифугируют при 1 000 g 2 мин. Супернатант содержит вышедшую РНК, а осадок — РНК, оставшуюся внутри ядер. Когда транскрипцию проводят в отсутствие клеточных экстрактов, выхода РНК не происходит, за исключением малых РНК (5S-PHK, предшественников ? тРНК, мяРНК) '[6]. Добавление экстракта (табл. 18), приго-

товленного из клеток миеломы, приводит к дополнительному выходу молекул РНК большего размера, в том числе poly(A+)-РНК [50]. Вышедшие РНК можно проанализировать на присутствие специфических транскриптов методом гибридизации., описанным выше.

, 6.6. Изучение регуляторных факторов

Важное применение изолированных ядер заключается в обнаружении с их помощью факторов, участвующих в регуляции, транскрипции и изучении взаимодействия этих факторов с хроматином. Мы использовали ядра, выделенные из зародышей морского ежа, для выявления и частичной очистки ингибитора РНК-полимеразы III, присутствующего в ядрах морского ежа [6]. Было показано [54], что экстракты ядер в 0,35 ? КС1 значительно снижают транскрипцию всеми тремя РНК-полимера-зами, а восстановление транскрипции достигается при добавлении белков 1 и 2 из группы белков с высокой электрофоре-тической подвижностью (HMG-белков; от англ. High Mobility Group). Таким образом, существует возможность обратимо изменять транскрипцию в изолированных ядрах. В будущем этот подход позволит значительно углубить представления о механизме регуляции транскрипции.

Благодарности

? Методы, описанные в этой главе, были разработаны в на-

ших лабораториях в течение последних десяти лет. Мы особо отмечаем вклад докторов А. Рива, М. Смита, Дж. Фрагосо,. Дж. Мошиера, Д. Купера, А. Браун, Дж. Моррис и Д. Ситмана в разработку многих методов в области исследований, описанных в данной главе. Эта работа была субсидирована NIH.

Литература

1. Marzluff W. F., Murphy ?. С, Huang R. С. С. Biochemistry (Wash.), 12, 340 (1973).

2. Marzluff W. F., Murphy E. C, Huang R. С. C. Biochemistry (Wash.), 13> 3689 (1974).

3. Tilghman S. M., Belayew A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5254 (1982).

358

Глава 4

4. Ernest ??. ??., Schultz G., Feigelsen P. Biochemistry (Wash.), 15, 824 (1976).

5. Price R., Penman S. J. Mol. Biol., 70, 435 (1972).

6. Morris G. M., Marzlujf W. F. Biochemistry (Wash.), 22, 645 (1983).

7. Panyim S., Chalkley R. Arch. Biochem. Biophys., 130, 337 (1969).

8. Zweidter A. Methods Cell Biol., 17, 223 (1978).

9. Thomas J. O., Kornberg R, D. Methods Cell Biol., 18, 429 (1978). .10. Harvey W., Atkinson B. G. Can. J. Biochem., 60, 21 (1982).

11. Gumeij Т., Foster D. N. Methods Cell Biol., 16, 45 (1977).

,12. Marzluff W. F., Huang R. С. С Proc. Natl Acad. Sci. USA, 72, 1082

(1975) .

»13. Roeder R. G. In: RNA Polymerase, Losick R. and Chamberlain M. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p. 285, 1976.

14. Wagner F. K., Katz L., Penman S. Biochem Biophys. Res. Commun., 28, 152 (1967).

15. Chirgwin J. M., Przbyla A. E., MacDonald R. J., Rutter W. 1. Biochemistry (Wash.), 18, 5294 (1979).

16. Benecke B.—J., Ben—Zeeti ?., Penman S. Cell, 14, 931 (1978).

17. McMaster G. K., Carmichael G. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4935

(1977).

18. Marzluff W. F., Pan C. J., Cooper D. L. Nucleic Acids Res., 5, 4177 (1978).

19. Gcody R. S., Eckstein F. J. Am. Chem. Soc, 93, 6252 (1971).

20. Goody R. S., Eckstein F., Sehinanu R. H. Biochim. Biophys. Acta, 276, 155 (1972").

21. Reeve A. E., Smith ?. ??., Pigiet V., Huang R. С. C. Biochemistry (Wash.), 16. 4464 (1977).

22. Smith ?. M., Reeve A. E„ Huang R. С. C. Cell, 15, 615 (1978).

23. Reeve A. E., Shot kin A. J., Huang R. С. C. J. Biol. Chem., 257, 7018 (1982).

24. Benz E. W., Wydro R. ??., Nadel—Ginard N.. Dina D. Nature, 288, 655 (1980).

25. Cuatrecasas P. J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970).

26. Smith ?. M., Huang R. С. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 775 (1976).

27. Huang R. С. C. In: Genetic Engineering Techniques, Huang R. С. C, Kuo Т. T. and Wu R. (eds.), Academic Press, p. 93, 1983.

28. lde G. Biochemistry (Wash.), 20, 2633 (1981).

29. Hipskind R. ?., Reeder R. H. J. Biol. Chem., 255, 7896 (1980).

30. Sun I. Y., Johnson ?. M., Alljrey V. G. Biochemistry (Wash.), 18, 4572 (1979).

31. Washington L. D., Stallcup M. R. Nucleic Acids Res., 10, 8311 (1982).

32. Connolly ?. ?., Rowaniuk P. J., Eckstein F. Biochemistry (Wash), 21, 1983 (1982).

33. Eckstein Г., Goody R. S. Biochemistrv (Wash.), 15, 1685 (1976).

34. Stallcup ??. R., Washington L. D. J. Biol. Chem., 258, 2802 (1983).

35. Brown ?., Marzluff W. F. Biochemistry (Wash.), 21, 4303 (1982).

36. Contreras R., Fiers W. Nucleic Acids Res., 9, 215 (1981).

37. Dale R. ?. K., Livingston D. C, Ward D. C. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 70, 2238 (1973).

38. Crouse G. F, Fodor E. J. В., Doty P. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 73 1564

(1976) .

39. O'Malley B. W., Tsai M. J., Tsai S. Y'., Towle H. C. Cold Soring Harbor Symp. Quant. Biol, 42, 605 (1978).

40. Carrol A. R., Wagner R. J. Biol. Chem