Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

льно промытой дистиллированной водой, рН которой доведен до 7,0 0,1 ? NaOH. Перемешайте и оставьте суспензию во льду на 5 мин.

3. Поместите суспензию в пластиковый шприц одноразового использования объемом 5 мл с концом, забитым стекловатой, и отцентрифугируйте (500^, 10 мин) раствор в чистую пробирку.

4. Повторите операции, описанные в пп. 2 и 3.

5. Осадите Hg-UTP двумя объемами абсолютного этанола. Отцентрифугируйте осадок.

6. Повторите операцию, описанную в п. 5.

7. Высушите Hg-UTP под вакуумом и растворите в 2 мл дистиллированной воды. Концентрация Hg-UTP должна быть 20 мМ.

1 По [19], с некоторыми изменениями.

168

Глава 5

Таблица 5. Транскрипция хроматина in vitro

1. Приготовьте реакционную смесь (в 2 мл конечного объема) следующего состава:

0,8 мМ раствор каждого из трифосфатов АТР, QTP, СТР 0,5 мМ UTP

0,3 мМ Hg-UTP (табл. 4) 1 мг ДНК хроматина

200—400 ед. РНК-полимеразы Е. coli (табл. 3) 14 мМ 2-меркаптоэтанол 5 мМ MgCl2 0,15 ? КС1

40 мМ трис-HCl, рН 7,9

2. Проинкубируйте смесь при 37 °С 1 ч и затем остановите реакцию добавлением 100 мкл 10%-ного саркозила и 50 мкл 0,1 ? ЭДТА.

3. Обработайте раствор ультразвуком, чтобы уменьшить вязкость (2—3 периода по 10 с), затем добавьте протеиназу К (Merck) до конечной концентрации 50 мкг/мл н проинкубируйте при 37 °С 15 мин.

4. Депротеинизируйте раствор, перемешивая его встряхиванием с равным объемом смеси фенол: хлороформ1 (1:1, по объему) и разделите фазы центрифугированием (lOOOg, 5 мин). Отберите верхний (водный) слой и добавьте к нему три объема абсолютного этанола. Перемешайте и оставьте раствор при —20 °С на 1 ч, чтобы нуклеиновые кислоты выпали в осадок.

5. Отцентрифугируйте осадок (5000g, 10 мин) и удалите оставшийся этанол под вакуумом.

6. Растворите осадок нуклеиновых кислот в 0,5 мл 10 мМ трис-HCl, рН 7,9, 50 мМ NaCl и нанесите на колонку (60X1 см) с сефадексом Q50, уравновешенную тем же буфером. Соберите фракции, соответствующие свободному объему, и осадите нуклеиновые кислоты этанолом согласно пп. 4 и 5.

7. Растворите нуклеиновые кислоты в 0,5 мл 10 мМ трис-HCl, рН 7,9. Храните их при —20 °С или сразу проведите хроматографию на тиолированной сефарозе, как описано в табл. 6.

1 Гидроксихинолин в фенол добавлять не следует, поскольку это ускоряет удаление ртути, связанной ковалентно с РНК.

рованной сефарозе с учетом особенностей, рассмотренных в разд. 4.1.

Получение Hg-UTP описано в табл. 4. Таким же способом можно меркурировать СТР и использовать его для транскрипции in vitro вместо Hg-UTP. Оба этих вещества продаются фирмами Sigma и Boehringer. Условия инкубации в случае ДНК-зависимой транскрипции хроматина РНК-полимеразой Е. coli и последующей экстракции РНК описаны в табл. 5. Меркурированные рибонуклеозидтрифосфаты прочно связываются с РНК-полимеразой и таким образом могут ингибировать активность фермента. Однако добавляемый в реакционную смесь 10—20 мМ 2-меркаптоэтанол конкурентно связывается ртутью в трифосфатах, и это способствует нормальному синтезу РНК- После экстракции меркурированные РНК-транскрипты очищают с помощью аффинной хроматографии на тиолированной сефарозе, как описано в табл. 6, и затем их можно коли-

Транскрипция хроматина

169

Таблица 6. Очистка меркурированных РНК-транскриптов на тиолированной сефарозе

1. Промойте колонку (объемом 1 мл) с тиолированной сефарозой 5 мл буфера, имеющего состав: 10 мМ трис-HCl, рН 7,9, 0,2 ? NaCl, 1% ДСН, 0,3 ? 2-меркаптоэтанол.

2. Промойте колонку 15 мл этого буфера без 2-меркаптоэтанола.

3. Прокипятите раствор нуклеиновой кислоты (табл. 5, п. 7) 4 мин и затем быстро охладите во льду.

4. Добавьте к нему равный объем охлажденного во льду указанного выше буфера двукратной концентрации без 2-меркаптоэтанола, перемешайте и нанесите смесь на предварительно уравновешенную колонку с тиолированной сефарозой. Оставьте ее на колонке на 10 мин без элюции, чтобы дать возможность меркурированной РНК связаться с носителем. Элюируйте не связавшуюся РНК с колонки указанным выше буфером без 2-меркаптоэтанола.

5. Элюируйте меркурированную РНК с колонки 2 мл того же буфера с 0,3 ? 2-меркаптоэтанолом.

6. Осадите меркурированную РНК этанолом и отцентрифугируйте ее (табл. 5, пп. 4 и 5).

7. Повторите операцию, описанную в п. 6.

8. Промойте'осадок меркурированной РНК 5 мл 75%-ного этанола (охлажденного до 4°С) и отцентрифугируйте осадок (табл. 5, п. 5).

9. Лиофилизуйте меркурированную РНК, растворите ее в дистиллированной воде и храните при —20°С.

чественно анализировать методом гибридизации с кДНК (разд. 5.1) или картировать с помощью нуклеазы S1 '(разд. 5.2).

5. Анализ РНК-транскриптов

5.1. Гибридизация со специфическими ДНК-зондами

Точное определение количества специфического транскрипта проводят методом гибридизации РНК со специфической [3Н] ¦ кДНК-зондом или геномной [3Н]-ДНК. После этого добавляют нуклеазу S1 для расщепления негибридизованной ДНК. Меркурированные нуклеиновые кислоты не гибридизируются с комплементарными зондами, особенно при высокой степени замещения на Hg-UTP [17, 20]. Однако при взаимодействии с ти-ольными реагентами [24] происходит демеркурирование РНК, и поэтому транскрипты, выделенные методом связывания на тиолированной сефарозе с последующей элюцией тиольным соединением (табл. 6), демеркурированы в достаточной степени [23], чтобы гибридизоваться.

Методы выделения очищенной мРНК и обратной транскрипции для получения меченой кДНК подробно описаны [25]. Поскольку количество специфического РНК-транскрипта оценивается прямо по радиоактивности гибридизованной ДНК, ус-

170

Глава 5

Таблица 7. Гибридизация РНК-транскриптов с ДНК-зондами

?. Добавьте определенное количество меченой ДНК (0,5—1,0 нг), растворенной в дистиллированной воде, к пробам, содержащим небольшие количества РНК-транскрипта (0,1—2,0 мкг), и лиофилизуйте растворы.

2 Растворите каждую пробу в 5 мкл 0,5 ? NaCl, 1 мМ ЭДТА, 50%-ного деионизованного формамида1, 25 мМ HEPES, рН 6,7. Запаяйте каждую пробу в силиконированном стеклянном капилляре, прогрейте при 100 С 5 мин и затем инкубируйте при 43 °С 2 дня.

3. Перенесите каждую пробу в 0,25 мл раствора, имеющего состав: 2,8 мМ ZnS04, 0,14 ? NaCl, 15 мкг/мл денатурированной ДНК тимуса теленка, 70 мМ натрийацетатный буфер, рН 4,5.

4. Добавьте 100 мкл нуклеазы S1 (1000 ед.), проинкубируйте при 37 °С 2 ч и затем поместите в лед на 5 мин.

5. Отберите по 100 мкл из каждой пробы, добавьте к 10 мл сцинтиллятора Triton fluor2 и определите общую радиоактивность (Т) на сцинтилляционном счетчике.

6. Отберите по 200 мкл из каждой пробы и добавьте к этой аликвоте 50 мкл БСА (100 мкг/мл) и затем 50 мкл 6 н. хлорной кислоты. Перемешайте и оставьте во льду на 30 мин. Отцентрифугируйте при 2000^ 10 мин. Смешайте 200 мкл супернатанта с 10 мл сцинтиллятора Triton fluor и определите кислоторастворимую радиоактивность (S) на сцинтилляционном счетчике.

Процентное содержание ДНК-зонда в устойчивых к нуклеазе S1 гибридах вычисляют по формуле:

? —0.75S

Гибридизовавшаяся ДНК (в %)= -j- -100.

1 Формамид денонизуйте следующим образом. Встряхивайте 100 мл формамида с 10 г смешанной смолы (например, Bio-Rad AG 501—X8(D) 2 ч при комнатной температуре. Отфильтруйте смолу и храните формамид при —20 "С.

2 Для приготовления сцинтиллятора Tritton fluor растворите 0,75 г РОРОР и 12,5 г РРО в 2,5 л толуола. Добавьте к этой смеси половинный объем тритона Х-100.

тойчивой к нуклеазе S1, кДНК-зонд с длиной, меньшей, чем мРНК, даст заниженные оценки количества имеющейся РНК-Поэтому рекомендуется предварительно фракционировать [3Н]-кДНК центрифугированием в сахарозном градиенте, чтобы получить полноразмерные молекулы [25].

В табл. 7 описаны условия гибридизации, используемые в нашей лаборатории. В пробы с определенным количеством меченой кДНК добавляют увеличивающиеся количества РНК и количество гибридизовавшейся кДНК измеряют с помощью гидролиза нуклеазой S1 и последующего осаждения хлорной кислотой (табл. 7; [26]). С увеличением количества вносимой РНК процент гибридизующейся кДНК постепенно возрастает до максимальной величины (выходит на плато). Чтобы гибридизация прошла полностью, все реакции проводят как минимум до значения /?ot= Ю-1 моль-л-1-с, поэтому кривая гибридизации достигает плато в точке, когда количество внесенного специфического РНК-транскрипта эквивалентно количеству имеющейся [3Н]-кДНК- Перед тем как проводить анализ количества специфических РНК-транскриптов, синтезированных in vitro, реко-

Транскрипция хроматина

171

РНК/кДНК, мкг/нг

Рис. 1. Анализ насыщения гибридизации транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой Е. coli в системе с ядрами и хроматином печени плода мыши. Различные количества очищенных меркурированных РНК-транскриптов (табл. 6) гибридизовали с 0,05 нг радиоактивной глобиновой кДНК и определяли устойчивость кДНК к нуклеазе S1, как описано в табл. 7. Подробности можно найти в первой сноске к табл. 8. Приведенные кривые соответствуют: / — полная транскрипция в системе с ядрами; II (светлые кружки) —полная транскрипция в системе с ядрами в присутствии 10 мкг/мл ?-аманитина; II (светлые треугольники)—полная транскрипция в системе с ядрами + 10 мкг/мл а-аманитина+250 мкг/мл актиномицина D; IV—система с ядрами без добавления полимеразы; V — система с ядрами без добавления полимеразы+ 10 мкг/мл ?-аманитина; /// (темные кружки)—полная транскрипция в системе с хроматином; /// (темные треугольники) — полная транскрипция в системе с хроматином + 250 мкг/мл актиномицина D; VI (темные квадраты) — система с хроматином без добавления полимеразы!

мендуется предварительно построить калибровочную кривую с очищенной мРНК-

На рис. 1 и в табл. 8 приведены типичные результаты, полученные с использованием этого метода. В плане последующего обсуждения важно отметить, что на рис. 1 представлен лишь качественный анализ, с помощью которого характеризуется только тип синтезируемых РНК-транскриптов, тогда как их количественный выход не рассматривается. Вместе с тем в табл. 8 включены также данные, касающиеся вы

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)