оместите в лед.

5. Добавьте 2,5 мкл 0,1 ? MgCl2, 50 мМ ДТТ, 50%-ного глицерола, 0,5 ? трис-HCl, рН 9,5. Перемешайте и добавьте эту смесь к 125 мкКи [?-32?]-??? (>5000 Ки/ммоль), предварительно лиофилизованного и растворенного в 2,5 мкл воды.

6. Добавьте 20 ед. полинуклеотидкиназы (PL Biochemicals) и проинкубируйте при 37 °С 30 мин.

7. Добавьте 12,5 мкл 7,5 ? ацетата аммония

5,0 мкл дрожжевой тРНК (2 мг/мл) 90,0 мкл этанола

•Оставьте смесь в сухом льду на 10 мин и осадите ДНК центрифугированием (10 ???,? 5 мин).

176

Глава 5

8. Растворите осадок ДНК в 25 мкл воды и повторите осаждение ДНК согласно п. 7.

9. Промойте осадок ДНК 75%-ным этанолом. Растворите осадок в 80%-ном деионизованном формамиде2, 2,5 мМ ЭДТА, 0,1 ? трис-боратном буфере, рН 8,3.

10. Прогрейте при 90 °С 5 мин, чтобы денатурировать ДНК. Охладите до комнатной температуры и затем нанесите на 6%-ный полиакриламидный гель (длиной 40 см, толщиной 1 мм), приготовленный в 2,5 мМ ЭДТА, 0,1 ? трис-боратном буфере, рН 8,3. Лунка должна иметь глубину 1 см и ширину 1 см. Проведите электрофорез в том же буфере, в котором приготовлен гель, при 150 В в течение 24 ч при комнатной температуре.

И. Определите положение разделенных цепей3 ДНК путем кратковременной радиоавтографии при комнатной температуре. Для этого заверните влажный гель (оставив его на одной из стеклянных пластинок после электрофореза) в тонкую пластиковую пленку. В темной фотокомнате положите на гель рентгеновскую пленку (например, Fuji RX), оставьте ее на —-2 мин и затем проявите.

12. Вырежьте полоски геля, содержащие цепи ДНК, в соответствии с радиоавтографом. Элюируйте ДНК из каждой полоски отдельно следующим образом. Размельчите полоску геля в 0,2 мл 1%-ного ДСН, 0,2 ? ацетата натрия, рН 4,8 и проинкубируйте при 37 °С 16 ч.

13. Удалите кусочки геля центрифугированием. Осадите элюированную ДНК этанолом (табл. 5, пп. 4 и 5). Каждый осадок ДНК растворите в 50 мкл воды.

14. Определите, какая из цепей ДНК комплементарна изучаемому РНК-транскрипту. Наиболее простой способ сделать это — провести предварительную гибридизацию по методу, описанному в табл. 10, но с меченой мРНК-Другой вариант заключается в секвенировании ДНК [29].

' Наиболее подходящими для SI-нуклеазного картирования являются ДНК-зонды с-длиной 200—1000 bp.

2 Формамид деионизуйте способом, описанным в первой сноске к табл. 7.

3 Две цепи молекулы ДНК обычно разделяются в таком геле в силу различий их вторичной структуры, зависящих от последовательности оснований. Однако бывает, что» этих конформационных различий недостаточно, чтобы произошло разделение. В таком случае нужно использовать либо другой фрагмент ДНК, цепи которого разделяются, либо, если это невозможно, использовать в качестве зонда двухцепочечную ДНК. Поскольку гибридизацию, предшествующую картированию нуклеазой S1, проводят в условиях избытка ДНК (табл. 10, п. 1), некоторое количество ДНК будет гибридизоваться с РНК-транскриптами, что позволит провести картирование, хотя будет происходить также ренатурация цепей ДНК-зонда.

На рис. 2 показано применение Sl-нуклеазного картирования для анализа транскрипции in vitro эпсилон (|е)-глобиново-го гена человека РНК-полимеразой Е. coli с использованием в качестве матрицы хроматина и ядер эритролейкемических клеток К562 человека, которые конститутивно синтезируют е-глобин. На рис. 2, А показана область клона геномной ДНК, содержащего ?-глобиновый ген в плазмиде рМХ [31]. Удобным зондом для Sl-нуклеазного картирования является МЬо 11-фраг-мент (371 bp), поскольку он охватывает область, начинающуюся внутри первого экзона ?-глобинового гена и продложаю-щуюся в 5'-сторону от предполагаемого сайта инициации, или кэп-сайта. На рис. 2, Б показано использование МЬо П-фраг-мента, меченного по 5'-концу, для анализа транскрибированной in vitro РНК в системе, где в качестве матриц использовали ядра

Транскрипция хроматина

177

371 bp

тзоьр

I I

Рис. 2. Идентификация методом Sl-нуклеазного картирования сайта инициации синтеза ?-глобиновой РНК человека in vitro. А. Рестрикционная карта части рекомбинантной плазмиды рМХ [31], на которой показан район геномной ДНК человека, содержащий точку инициации транскрипции ?-глобинового гена человека. Черные блоки представляют собой экзоны, слева —первый экзон, справа —второй. Фрагмент длиной 371 bp, полученный при расщеплении рестриктазой MboU фрагмента Xbal-BglU, был помечен по 5'-кон-цу, и кодирующая ( + )-цепь (371 нуклеотид), показанная на рисунке, была выделена (табл. 9) и использована в качестве ДНК-зонда для Sl-нуклеазного картирования сайта инициации транскрипции РНК in vitro. Показано по-(продолжение см. на следующей странице)

178

Глава 5

или хроматин, выделенные из клеток К562. На первой и второй дорожках представлены ДНК, устойчивые к нуклеазе S1, после гибридизации кодирующей (-(-)-цепи МЬо П-фрагмента •соответственно с ядерными и хроматиновыми РНК-транскриптами. Дорожка 6 показывает результат аналогичного анализа суммарной РНК клеток К562. Во всех случаях видны два оди-лаковых главных защищенных фрагмента с размерами около 130 нуклеотидов каждый. Это означает, что сайт инициации транскрипции находится на расстоянии приблизительно 130 .нуклеотидов от МЬо П-сайта в первом экзоне (рис. 2, Л). Предполагают, что наличие двух фрагментов связано с гетерогенностью Sl-нуклеазного гидролизата или самого сайта инициации in vitro. Как видно на дорожках 3 и 4, в отсутствие РНК-полимеразы в реакционных смесях транскрипции in vitro защищенность ДНК-зонда от расщепления очень невелика. Поскольку в инкубационные смеси на дорожках 1 и 2 был внесен «-аманитин, в анализируемых в них РНК гарантируется отсутствие продукта остаточной активности РНК-полимеразы II. Действительно, синтез специфических ?-глобиновых транскриптов можно подавить внесением 400 мкг/мл рифампнцина, что свидетельствует о том, что наблюдаемая транскрипция является результатом инициации de novo экзогенной РНК-полимеразой Е. coli. Стоит отметить, что для получения одинакового количества гибридов, устойчивых к нуклеазе S1, хроматина клеток К562 требуется в 5 раз больше, чем ядер. Следователь-.но, хроматин является гораздо менее эффективной матрицей для РНК-полимеразы Е. coli, тогда как сайты инициации транскрипции ?-глобинового гена in vitro для обеих матриц одинаковы. Во всех случаях транскрипция является асимметричной, поскольку с некодирующей (—)-цепью МйоП-ДНК-зонда гибридизации не наблюдается (данные не показаны).

ложение фрагмента (130 нуклеотидов), защищенного от расщепления нуклеазой S1 (см. ниже). Б. Эритролейкемические клетки К562 индуцированы 1 мМ гемином в течение 5 дней и использованы для выделения ядер и хроматина (табл. 1). Меркурированная РНК была синтезирована in vitro в системе с ядрами или хроматином клеток К562 (табл. 5), а затем очищена (табл. 6). Описанную выше в А ДНК-зонд, взятую в избытке, гибридизовали с РНК-транскриптами, обрабатывали нуклеазой S1 и затем защищенные ¦фрагменты зонда разделяли электрофорезом и выявляли с помощью радиоавтографии, как описано в табл. 10. Дорожки 1 и 3 — меркурированная РНК из ядер клеток К562 (1 мг ДНК), инкубированных в присутствии 10 мкг/мл ?-аманитина соответственно с добавлением или без добавления 200 ед. РНК-полимеразы Е. coli; дорожки 2 и 4 — меркурированная РНК нз хроматина клеток К562 (5 мг ДНК), инкубированного с 10 мкг/мл ?-аманитина соответственно с добавлением или без добавления 200 ед. РНК-полимеразы ?. coli; дорожка 5 — РНК, синтезированная на ДНК pATHeG (20 мкг), инкубированной со 100 ед. РНК-гюлимеразы Е. coli; дорожка 6—10 мкг суммарной РНК клеток К562.

Транскрипция хроматина

179·

Таблица 10. Картирование немеченых РНК-транскриптов с помощью нуклеазы S11

1. Прогибридизуйте каждую пробу немеченых РНК-транскриптов с соответствующей одноцепочечной [32Р]-ДНК-зондом (приготовленной, как описано в табл. 9) в условиях избытка ДНК2. Проведите гибридизацию при 57 °С 16 ч в 10 мкл 80%-ного деионизованного формамида3, 0,4 ? NaCl, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ PIPES (рН 6,4, доводится NaOH). Вначале, чтобы определить оптимальные условия для картирования нуклеазой S1, рекомендуется поставить серию гибридизаций (см. п. 3 ниже).

2. После гибридизации добавьте 200 мкл охлажденной во льду смеси: 0,25 ? NaCl, 200 мкг/мл денатурированной ДНК тимуса теленка, 1 мМ ZnS04, 30 мМ ацетат натрия, рН 4,6.

3. Проинкубируйте смесь в различных условиях гидролиза нуклеазой S1, чтобы определить наиболее подходящую систему для каждого случая (разд. 5.2.2). Как правило, проводят серию гибридизаций при 10, 20 или 40 °С с 2000 ед. нуклеазы SI 1, 2 или 5 ч.

4. Осадите нуклеиновую кислоту этанолом, как описано в табл. 5, пп. 4 и 5.

5. Растворите осадок ДНК в небольшом объеме 80%-ного формамида3, 1 %-ного бромфенолового синего, 2,5 мМ ЭДТА, 0,1 ? трис-боратного буфера, рН 8,3.

6. Определите размеры устойчивых к нуклеазе S1 гибридных молекул методом электрофореза в 6%-ном полиакриламидном секвенирующем геле. Подробности метода приготовления геля приведены в разд. 3 обзора [29], где описано приготовление 8%-ного секвенирующего геля. Для 6%-ных гелей в этом обзоре приведен следующий состав исходного раствора:

120 мл 50%-ного акриламида, 2%-ного бисакриламида 460 г мочевины

100 мл 2,5 мМ ЭДТА, 0,1 ? трис-боратного буфера, рН 8,3 вода до 1 л Чтобы приготовить 6%-ный гель, смешайте: 60 мл исходного раствора 100 мкл TEMED

400 .мкл 10%-ного персульфата аммония Залейте пипеткой гелевую смесь между двумя стеклянными пластинами (20X40 см) с зазором 1 мм и погрузите в гель шаблон. После полимеризации выньте шаблон, прогрейте пр'обы при 60 °С 15 мин и нанесите по 5 мкл каждой пробы в отдельные лунки, пользуясь пипеткой с тонким оттянутым кончиком. Проводите электрофорез в геле (вертикально) в 2,5 мМ ЭДТА, 0,1 ? трис-боратном буфере, рН 8,3, при постоянной мощности 42 Вт (1400 В и 30 мА) до тех пор, пока бромфеноловый синий не пройдет 35 см. Во время электрофореза температура геля должна быть ~60°С.

7. После электрофореза