|
|
Транскрипция и трансляция. Методыпроцедура. 2. Система проще, чем мини-клетки, для проверки большого числа плазмид. 1. Может использоваться для любой клонированной ДНК, в том числе для небольших линейных фрагментов. Это позволяет однозначно соотнести продукты клонированной ДНК со сравнительно небольшими ее участками и отличить их от продуктов, кодируемых вектором. 1. Использование системы, естественно, ограничивается векторами на основе фага ?. 2. Остаточный фоновый синтез хозяйских полипептидов с мол. массой ниже 20 кДа может помешать обнаружению продуктов клонированного гена в этом диапазоне мол. масс 3. Меченые аминокислоты включаются со сравнительно низкой эффективностью, поэтому для обнаружения меченых продуктов необходимы флюорография и длительные экспозиции 1. Большое число копий некоторых генов, клонированных в плазмидах, может нарушить образование мини-клеток и/или помешать их эффективной очистке. 2. Введение дополнительных мутаций (например, гес А) в штамм-продуцент мини-клеток может приводить к тем же последствиям. 3. Мини-клетки трудно фракционировать. 1. Систему довольно трудно отладить. 2. Интерпретация результатов часто затруднена из-за присутствия продуктов абортивной трансляции и/или протеолитического расщепления, особенно ? случае больших белков (>60 кДа). 188 Глава 6 Продолжение Система Достоинства Недостатки 2. Весьма эффективное включение метки позволяет быстро анализировать продукты. 3. Может использоваться для изучения экспрессии генов. 4. Имеет значительные преимущества в тех случаях, когда необходимо идентифицировать продукты неохарак-теризованного гена. клеток в присутствии ,[35S]-метионина позволяет избирательно пометить белки, кодируемые плазмидой. 3. Система макси-клеток. Клетки УФ-чувствительного штамма Е. coli облучают небольшой дозой УФ-света, и поврежденная ДНК быстро деградирует во время последующей инкубации. Благодаря небольшому размеру мишени по сравнению с бактериальной хромосомой часть плазмидных молекул уцелеет при такой обработке. Поэтому введение [355]-метионина в сре- Таблица 2. Характеристики некоторых плазмид1 Раз- Чи(сло копий Плазмида (на один Гены Продукты генов и их мер, kb бактериаль- мол. масса ный геном) pACYC184 4,0 pLG517 10,4 pBS42 12,2 Устойчивость к хлор-амфениколу (CmR) Устойчивость к тетрациклину (TcR) dacC Тс" dacA Устойчивость к кана-мицину (KmR) Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT); 25 кДа Белок, определяющий устойчивость к тетрациклину; 34 кДа Пенициллинсвязыва-ющий белок 6 (РВР6); 40 кДа Белок, определяющий устойчивость к тетрациклину; 34 кДа Пенициллинсвязыва-ющий белок 5 (РВР5); 42 кДа Канамицинфосфо-трансфераза I (Кап); 27 кДа Карты плазмид приведены на рис. 1. Прокариотические системы экспрессии генов in vivo 189 Таблица 3. Состав сред и буферных растворов Агар Луриа (L-агар)1 1%-ный триптон (фирмы Oxoid) 0,5%-ный дрожжевой экстракт (Oxoid) 0,5%-ный NaCl 1,5%-ный агар (Oxoid № 3) Доведите ? ? до 7,4 Минимальная среда М9 [6] 40 мМ Na2HP04 20 мМ КН2Р04 8 мМ NaCl 20 мМ NH4C1 1 мМ СаС12 10 мМ MgS04 Проавтоклавируйте растворы СаС12 и MgS04 отдельно от других компонентов и смешайте, когда они остынут. Храните при комнатной температуре. Питательный бульон Приготовьте 2,5%-ный водный раствор сухой питательной среды (Oxoid № 2). Проавтоклавируйте его при 1 атм 15 мин и храните при комнатной температуре. Питательный агар Добавьте в питательный бульон агар (Oxoid № 3) до концентрации 1,5%. «Триптиказный» агар2 1%-ный «триптиказный» пептон 0,5%-ный NaCl 1,5%-ный агар (Oxoid № 3) Бактериальный буфер 50 мМ Na2HP04 20 мМ КН2Р04 70 мМ NaCl 0,4 мМ MgS04 Проавтоклавируйте и храните при комнатной температуре. Лямбда-буфер 10 мМ MgS04 0,05%-ная (вес/объем) желатина 6 мМ трис-HCl, рН 7,2 Проавтоклавируйте и храните при комнатной температуре. Буфер для нанесения на гель для электрофореза с ДСН 0,125 ? трис-HCl, рН 6,8 20%-ный глицерол 2%-ный ДСН 5%-ный 2-меркаптоэтанол 0,001%-ный (вес/объем) бромфеноловый синий Храните при комнатной температуре. Буфер СТЭТ 8%-ная (вес/объем) сахароза 5%|-ный тритон Х-100 50 мМ ЭДТА 50 мМ трис-HCl, рН 8,0 Проавтоклавируйте и храните при 4°С. 1 Мягкий агар Луриа содержит 0,7% агара. 2 Мягкий «триптиказный» агар содержит 0,7% агара. 190 Глава 6 ?+ ? dacC ApdacC ? =^"^M™t ' ? ? Рис. 2. Карты бактериофагов, рассмотренных в настоящей главе в качестве примеров. А. Бактериофаг ?+; указаны промоторы Рь и Pr и направление транскрипции с них во время инфекции. В лизогенных штаммах эти промоторы подавлены продуктом гена cl, который транскрибируется вместе с телом rex (его функция неизвестна) с промотора Рм. Более подробно биологические свойства фага ? описаны в работе [3]. Б. Бактериофаг XpdacC—вектор для клонирования на основе фага ?, содержащий fcoRI-фрагмент dacC, кодирующий пенициллинсвязывающий белок 6 Е. coli (РВР6). ду при последующей инкубации позволяет избирательно пометить белки, кодируемые плазмидой. Эту систему обычно называют макси-клетками в отличие от описанных выше мини-клеток. Каждая из трех систем имеет свои преимущества и недостатки. Выбор той или иной системы экспрессии генов in vivo зависит прежде всего от вектора, использованного для клонирования, и от самого клонированного гена. Сравнительная оценка этих систем приведена в табл. 1. Кроме того, в таблицу включены для сравнения характеристики системы экспрессии in vitro, разработанной Зьюби и описанной в гл. 7. Свойства плазмид, рассмотренных в качестве примеров в настоящей главе, приведены в табл. 2 и на рис. 1, а карты бактериофагов — на рис. 2. Состав общих для всех трех систем сред и буферных растворов указан в табл. 3. 2. Система клеток-хозяев, облученных УФ-светом 2.1. Введение В системе клеток-хозяев, облученных УФ-светом, транскрипция бактериальной хромосомы подавляется большой дозой УФ-облучения [1, 2]. При последующем заражении фагом ? лишь <фаговая ДНК может служить матрицей для транскрипции. Добавление [35S]-метионина позволяет специфически пометить кодируемые фагом белки. Биология фага ? и его использование :в качестве вектора для клонирования рассмотрены в сравнительно недавно опубликованном обзоре [3]. Прокариотические системы экспрессии генов in vivo 191' Рис. 3. Анализ кодируемых фагом белков, синтезированных в УФ-облучен-ных клетках. Фагоспецифичные белки были помечены, как описано в табл 8 Образцы анализировали в 15%-ном ПААГ в присутствии ДСН и флюорогра-фировали. Дорожки /, 2 и 3 (хозяйский штамм Е. coli \ЬШпа) экспонировали 3 сут, а дорожку 4 (хозяйский штамм Е. coli 159) —2 ч. / — контроль-2 — ?+; 3 — XpdacC; 4 — ?+. Дорожка 4 демонстрирует спектр белков, кодируемых фагом ? и синтезируемых в нелизогенном хозяине; в то же время' в лизогенном по фагу хозяине синтезируются только два основных белка — продукты генов тех и cl, расположенных в области иммунности фага ? Из электрофореграммы 3 видно, что синтезируется дополнительный белок РВР6, кодируемый XpdacC (см. табл. 2). 192 Глава 6 Если бактериальный штамм, используемый для облучения, лизогенен по фагу ?, то клетки будут содержать белок-репрес-сор (продукт гена cl). Он свяжется с любой суперинфицирующей фаговой ДНК и полностью подавит транскрипцию с основных промоторов PL и Pr. В этих условиях должна транскрибироваться только область иммунности, кодирующая продукты генов cl и rex и имеющая собственный промотор ([3]; см. также рис. 3). Будут транскрибироваться также любые бактериальные гены, клонированные вместе со своими промоторами в составе суперинфицирующего фага. Это позволит избирательно пометить продукты клонированных генов. Очевидно, этот подход не годится для генов, клонированных в фаговом векторе без бактериальных промоторов или если бактериальные гены имеют очень слабые промоторы, поскольку в этом случае их экспрессия зависит от транскрипции с сильных фаговых промоторов PL или Pr. Хотя в настоящей главе мы обсудим только заражение Е. coli фагом ?, подобные системы использовались для идентификации белков, кодируемых специализированными трансдуци-рующими фагами Р22 Salmonella typhimurium [4] и 029 Bacillus subtilis [5]. 2.2. Материалы и штаммы Материалы и штаммы, используемые для системы клеток-хозяев, облученных УФ-светом, перечислены в табл. 4. Таблица 4. Штаммы и растворы, необходимые для приготовления системы УФ-облученных хозяйских клеток Штаммы бактерий1 Е. coli 159 uvrA или ?. coli 159 uvrA (? ind) Бактериофаги Например, ?+ (титр 1010 БОЕ/мл) Растворы Среда М9 с мальтозой (раствор мальтозы автоклавируют отдельно и добавляют в минимальную среду М92 в качестве источника углерода) Среда М9 с мальтозой, содержащая 20 мМ MgCb Лямбда-буфер2 [35Sj-метионин (10 мкКи/мкл; 1000 Ки/ммоль; Amersham International) L-метионин (8 мг/мл) Бактериальный буфер2 Буфер для нанесения на гель для электрофореза с ДСН2 1 Подробнее о выборе штамма бактерий-хозяев см. в разд. 2.3. 3 Приготовление описано в табл. 3. 2.3. Штамм бактерий-хозяев В качестве штамма-хозяина обычно используют Е. coli 159 (uvrA gal rpsL) [1]. Мутация uvrA инактивирует один из важнейших путей репарации ДНК в клетках и делает их осо- Прокариотические системы экспрессии генов in vivo 193 _Таблица 5. Получение фага1_ 1. Вырастите ночную культуру штамма бактерии-хозяина в питательном бульоне, содержащем 10 мМ MgCl2. 2. Подготовьте серийные разведения фага в конечном объеме фагового буфера 100 мкл. Добавьте к каждому разведению 50 мкл культуры бактерий и оставьте на 10 мин при комнатной температуре, чтобы произошла адсорбция фага. 3. Добавьте к каждому разведению 3 мл расплавленного мягкого агара Луриа2, который перед этим стоял при температуре 50 °С. Быстро перемешайте смесь и налейте ее поверх свежеприготовленного агара Луриа1 в чашках. 4. Проинкубируйте чашки при 37 °С в течение ночи. Если фаг несет мутацию cl 857, проинкубируйте чашки вначале 20 мин при 42 °С, а потом в течение ночи при 37 |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 |
Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |