°С.

5. Выберите чашку с таким разведением фага, чтобы бляшки почти сливались. Налейте на поверхность 3 мл фагового буфера и оставьте на 30 мин при комнатной температуре.

6. Отберите буфер (теперь уже содержащий фаг) пипеткой в колбу Маккартни. Удалите дебрис центрифугированием в течение 10 мин при 3000 g (например, в роторе Sorvall SS34 при 5000 об/мнн). Добавьте несколько капель хлороформа, чтобы убить оставшиеся бактерии, и храните суспензию фага при 4°С3.

7. Оттитруйте суспензию фага, как описано в табл. 6.

' Составы сред и буферных растворов даны в табл 3

менты ДвдТас\у?Те3^ЬхороФ™а как А^Т eC™ °™ псодерж" чужеродные фраг-среде бляшки гораздо меньшего^азмРпяФв аДпК0Г0 ТИПа' ПоэтомУ °ни дают на богатой

НЭ Пето^ДНЬ™ П°ЛУЧаЮТСЯ Фаг до= быГ^вед-Так! Ж^.зо*^рГ^Ж^'Ж

Таблица 6. Титрование фага1

1. Вырастите ночную культуру штамма бактерии-хозяина в питательном бульоне, содержащем 10 мМ MgCb.

2. Приготовьте серийные разведения (в конечном объеме 100 мкл) фага в лямбда-буфере. Добавьте к каждому разведению 50 мкл культуры бактерий и оставьте на 20 мин при комнатной температуре для адсорбции фага.

3. Добавьте к каждому разведению 3 мл расплавленного мягкого L-arapa, охлажденного до 50 °С. Быстро перемешайте смесь и вылейте ее на свежеприготовленные чашки с L-агаром2.

4. Проинкубируйте чашки в течение ночи при 37 °С.

5. Подсчитайте число бляшек в каждом разведении и вычислите титр фага в БОЕ/мл.

2 vTJ^t СреД И бУФеРных растворов даны в табл. 3.

^^Пен^-ж^г^а1: ^sa-tr^ —"

^ся ЛомТ ипп ЫМ\К Уф-°бдУчен™- Этот штамм заража-иий в* тРНК' оК?°ФеН И Н6 содеРжит суирессорных мута-Е coli 159 И ,2Г« используют лизогенное производное Hum^L ( }· В НОрме облУчение УФ-светом индуцирует вырезание интегрированного фага (профага), но фаг ? ind 17-

13-953

194

Глава 6

Таблица 7. Концентрирование препаратов фага

Фаги легко сконцентрировать осаждением в ПЭГ или центрифугированием в градиенте CsCl. Осаждение в ПЭГ

1. Добавьте к суспензии фага примерно 2/з объема 25%-ного (вес/объем) ПЭГ-6000, 1,25 ? NaCl.

2. Проинкубируйте не менее 1 ч при 4°С; можно оставить смесь и на ночь.

3. Отцентрифугируйте 10 мин при 3600g при 4 "С (например, при 5000 об/ми» в роторе Sorvall GS3).

4. Отбросьте супернатант и удалите избыток влаги с осадка.

5. Ресуспендируйте осадок фага в 1—2 мл фагового буфера1. Центрифугирование в CsCl: метод ступенчатого градиента

1. Приготовьте растворы CsCl с плотностью 1,7; 1,5 и 1,3 г/мл (коэффициент преломления 1,3952; 1,3800 и 1,3687 соответственно), смешав насыщенный раствор CsCl с фаговым буфером.

2. Налейте 5 мл раствора с наибольшей плотностью (1,7 г/мл) в прозрачную центрифужную пробирку (2,5X8,75 см). Сверху осторожно наслоите 5 мл раствора с плотностью 1,5 г/мл и затем 5 мл раствора с плотностью 1,3 г/мл. Сверху наслоите суспензию фага.

3. Отцентрифугируйте 2—6 ч при 60 OOOg при 15 "С (например, в роторе Beckman SW27 при 22 000 об/мин).

4. Фаговые частицы образуют отчетливую белую полоску в середине слоя с плотностью 1,5 г/мл. Ее видно лучше всего, если освещать ультрацентрифужную пробирку сверху. Локализовав полоску, нанесите на боковую поверхность пробирки немного вакуумной смазки и проткните пробирку череэ смазку шприцем. Отберите фаг с помощью этого шприца и перенесите препарат в стеклянную колбу Мак-Картни.

5. Добавьте несколько капель хлороформа и храните препарат при 4 °С. В растворе CsCl фаговые частицы вполне стабильны. Если же это необходимо, CsCl можно удалить диализом против фагового буфера.

Градиентное центрифугирование в CsCl: метод самообразующегося градиента

1. Доведите плотность суспензии фага до 1,5 г/мл (коэффициент преломления 1,3800) с помощью насыщенного раствора CsCl.

2. Перенесите смесь в прозрачную ультрацентрифужную пробирку (например, 1,5x7,5 см). Если нужно, заполните оставшуюся часть пробирки раствором CsCl в фаговом буфере с той же плотностью. Тщательно перемешайте.

3. Отцентрифугируйте 40 ч при 100 OOOg" при 15 °С (например, в роторе Beck-man 50 Ti при 35 000 об/мин).

4. Отберите фаг и проведите операции, описанные в пп. 4 и 5 метода ступенчатого градиента.

1 Состав фагового буфера (лямбда-буфера) дан в табл. 3.

сет мутацию, подавляющую эту индукцию. Впрочем, для облучения используют такую большую дозу, что это, по-видимому, излишняя предосторожность, поскольку сам профаг сильно повреждается УФ-светом.

2.4. Получение фага

Методы получения и титрования фага описаны в табл. 5 в 6; их также легко найти в литературе [6, 7]. В идеале суспензия фага должна иметь титр не менее 1010 БОЕ/мл, чтобы

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

195

клетки можно было заражать с высокой множественностью (5—10 БОЕ на клетку; см. разд. 2.5, п. 4). Если необходимо, препарат фага можно сконцентрировать осаждением в ПЭГ и/или центрифугированием в градиенте плотности CsCl (табл. 7 и работы [6—8]). Перед использованием препарат фага следует хорошо диализовать, чтобы удалить эндогенный метионин, иначе включение метки может оказаться низким. Суспензии фагов хранят обычно в стеклянной посуде, промытой хромовой смесью или концентрированной серной кислотой для удаления следов детергентов, к которым фаги весьма чувствительны. К суспензиям всегда добавляют несколько капель хлороформа, чтобы убить любые бактериальные примеси. Перед использованием суспензии следует удалить хлорофором, про-булькивая через суспензию фага стерильный воздух или азот.

2.5. Методика введения метки в кодируемые фагом белки

Все стадии получения системы клеток-хозяев, облученных УФ-светом, перечислены в табл. 8. Однако некоторые детали методики следует обсудить более подробно.

1. Использование для выращивания клеток-хозяев минимальной среды М9, содержащей мальтозу в качестве единственного источника углерода, имеет веские причины. Фаг ? может инфицировать клетки Е. coli только в том случае, если на поверхности клетки присутствует продукт гена lam В. Этот белок участвует в транспорте мальтозы и служит в то же время рецептором фага. В норме он содержится в количестве всего нескольких молекул на клетку, но ген lam В можно индуцировать, выращивая бактерии на мальтозе: при этом образуется гораздо больше рецепторного белка. Таким образом, индукцию гена lam В можно использовать для увеличения эффективности заражения фагом. В среду не добавляют глюкозу, поскольку это вызывает катаболитную репрессию мальтозного оперона.

2. Штаммы Е. coli 159 и 159 (? ind) медленно растут на минимальной среде М9, содержащей мальтозу: время удвоения составляет около 120 мин. При желании можно добавить в среду глицерол до конечной концентрации 0,4% (по объему); это снижает время удвоения до 90 мин. Если Л450 культуры после инкубации при 37 °С больше или меньше указанной величины 0,64 (табл. 8, п. 2), но клетки продолжают расти экспоненциально, культуру можно развести или сконцентрировать (с помощью центрифугирования) до нужной плотности. Важно точно знать число клеток, взятых в эксперимент, чтобы провести заражение с нужной множественностью.

3. После облучения (табл. 8, п. 3) клетки концентрируют в пять раз в среде, содержащей 20 мМ MgCl2 (пп. 4 и 5).

13·

196

Глава 6

Таблица 8. Мечение кодируемых фагом белков в системе УФ-облученных клеток-хозяев1

1. Растите хозяйский штамм в среде М9 с мальтозой при 37 "С в течение ночи.

2. Разведите культуру до Аио = ОЛ и растите при 37°С до /l45o = 0,64 (— 2· 108 клетка/мл). В этих условиях время удвоения Е. coli 159 составляет примерно 120 мин2.

3. Перенесите 10 мл этой культуры в чашку Петри диаметром 9 см. Толщина слоя жидкости не должна превышать ~0,3 см. Облучите чашку УФ-светом с длиной волны 254 нм (доза 1200 Дж/м2), покачивая чашку,, чтобы все клетки были облучены.

4. Для каждой пробы поместите 500 мкл культуры в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. Осадите клетки (2 мин в микроцентрифуге) и отбросьте супернатант.

5. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл предварительно подогретой среды ?9· с мальтозой, содержащей 20 мМ MgCl2- Добавьте фаг ? в 10—100 мкл фагового буфера; множественность заражения должна составлять 5—10 БОЕ на клетку. В контрольную пробу добавьте эквивалентный объем фагового буфера без фага.

6. Проинкубируйте 10 мин при 37 °С.

7. Добавьте 400 мкл предварительно подогретой среды М9 с мальтозой га проинкубируйте еще 20 мин при 37°С.

8. Добавьте 10—100 мкКи [355]-метионина (10 мкКи/мкл; 1000 Ки/ммоль> и проинкубируйте 10 мин при 37°С.

9. Добавьте 200 мкл немеченого L-метионнна (8 мг/мл) и проинкубируйте 5 мин при 37 "С.

10. Охладите образцы во льду 2 мин. Осадите клетки (микроцентрифуга,. 2 мин) и отбросьте супернатант.

11. Суспендируйте осадок клеток в бактериальном буфере и снова отцентрифугируйте клетки. Отбросьте супернатант.

12. Ресуспендируйте клетки в 25 мкл бактериального буфера и добавьте 25 мкл буфера с ДСН для нанесения на гель для проведения электрофореза. Проинкубируйте 3 мин в кипящей водяной бане.

13. Нанесите по 25 мкл из каждой пробы на пластинку геля ПААГ — ДСН3. Остаток храните при —20°С.

14. После электрофореза проведите флюорографию геля, чтобы выявить меченые белки3.

? Состав сред и буферных растворов указан в табл. 3, подробное описание Штаммоэ бактерий-хозяев и фагов приведено в табл. 4.

2 Можно добавить в среду глицерол до концентрации 0,4%, это снижает время удвое-

НИЯ Д°о9писаИние подходящих методик электрофореза и флюорографии можно найти & работе [10].

Присутствие некоторого количества ионов магния необходимо как для обеспечения стабильности фаговых частиц, так и для адсорбции фага, но такая высокая концентрация магния, кроме того, предотвращает подавление белкового синтеза, которое наблюдается при заражении клеток фагом с высокой множественностью [1].

4. Обычно оптимальной является множественность заражения 5—10; если она ниже 5, меченый метионин включается слабо, если она слишком высока, то при заражении лизогенного штамма есть риск оттитровать весь репрессор, что приведет к экс-

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

197<