Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

p>прессии фаговых генов. Если в качестве хозяина используют лизоген по фагу ?, то критерием правильно подобранной множественности заражения служит экспрессия только двух фаговых белков — продуктов генов cl и rex при заражении фагом ? дикого типа (?+) (см. рис. 3,Б).

5. Незараженные хозяйские клетки также следует проинкубировать с [35S]-метионином, чтобы проверить остаточный уровень экспрессии бактериальных хромосомных генов. Для такой контрольной инкубации в смесь добавляют эквивалентное количество лямбда-буфера вместо суспензии фага (табл. 8, п. 5).

6. После добавления фага образцы инкубируют 10 мин при 37°С, чтобы фаг адсорбировался (табл. 8, п. 6). Затем образцы разводят, добавляют i[35S] -метионин и инкубируют еще 10 мин, чтобы пометить кодируемые фагом белки. После этого клетки инкубируют непродолжительное время с немеченым метионином, чтобы синтез меченых белков дошел до конца.

7. Клетки один раз промывают буфером, затем ресуспенди-руют в небольшом объеме буфера и подготавливают к анализу в ПААГ—ДСН. Поскольку эффективность включения метки обычно довольно низка, после электрофореза приходится проводить флюорографию геля, чтобы выявить меченые белковые продукты. Электрофорез в ПААГ—ДСН и флюорография были подробно описаны в вышедшем раньше томе настоящей серии

На рис. 3 приведены примеры мечения белков, кодируемых фагом, после заражения клеток, облученных УФ-светом.

2.6. Возможные проблемы 2.6.1. Высокий фон

Высокое фоновое включение [35S]-метионина в контроле (без добавления фага) указывает, что доза УФ-облучения (табл. 8, п. 3) слишком мала. При использовании системы с заражением фагом повышение дозы УФ-облучения снижает фон, но это сопровождается общим снижением белкового синтеза [11]. Приемлемый уровень фона зависит от эффективности экспрессии исследуемых генов, так что оптимальную дозу облучения, возможно, придется определять эмпирически. Обычно применяют дозы от 400 до 1200 Дж/м2. Для получения воспроизводимых результатов рекомендуется использовать дозиметр.

2.6.2. Низкое включение

Эффективность включения [35S]-метионина часто оказывается существенно ниже, чем при использовании систем мини-и макси-клеток, особенно если в качестве хозяина берут лизо-

198

Глава 6

геный штамм. Для повышения эффективности включения необходимо помнить следующее:

1. Фаголизат должен иметь достаточно высокий титр (1010 БОЕ/мл) и должен быть как следует диализован против лямбда-буфера (табл. 3) перед употреблением.

2. Удельная радиоактивность [35S]-метионина должна быть максимальной (>1000 Ки/ммоль).

3. Доза УФ-облучения должна быть минимальной, обеспечивающей приемлемый уровень фонового включения (разд. 2.6.1).

4. Флюорография ПААГ после электрофореза для выявления меченых продуктов должна проводиться в условиях максимальной чувствительности. Может оказаться полезной предварительная кратковременная засветка рентгеновской пленки для повышения ее чувствительности [10, 12],

2.7. Использование нелизогенного хозяина

Белки, которые кодируются трансдуцирующими фагами ?, можно обнаружить и при заражении нелизогенных клеток Е. coli, облученных УФ-светом. В этом случае из-за отсутствия репрессора в клетках происходит транскрипция фаговых генов и клонированных генов с промоторов PL и Ря. Это может оказаться полезным, если хромосомные гены имеют очень слабые промоторы или были отделены от своих собственных промоторов.

2.8. Использование фагов с другими областями иммунности

2.8.1. Репрессия областей иммунности фагов 434 и 21

Хотя выше речь шла только о фагах, содержащих область иммунности ?, многие векторы, использующиеся для клонирования, имеют области иммунности фагов 434 или 21. Чтобы репрессировать основные транскрипционные единицы этих фагов, следует использовать в качестве штаммов-хозяев Е. coli 159 (? imm 434) или 159 (? imm 21) соответственно. Однако эти профаги не подавляют суперинфицирующие фаги столь же эффективно, как профаг imm ?. Поэтому, работая с фагами, имеющими область иммунности 434, авторы используют в качестве штамма-хозяина Е. coli 159, несущую плазмиду pGYlOl. Плазмида pGYlOl содержит ген репрессора фага 434 и продуцирует примерно в 70 раз больше респрессорного белка, чем профаг ? imm 434 [13]. Была также сконструирована плазмида с геном репрессора фага 21 [14]. Она может быть использована для фагов i'mm21. Альтернативный метод подавления экспрессии

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

199

генов фага imm2\ состоит в сокращении до минимума продолжительности всех инкубации [15]: дело в том, что число фагов, преодолевающих иммунологический барьер при заражении, по-видимому, существенно возрастает при увеличении времени инкубации.

2.8.2. Фаги с гибридным иммунитетом

Более совершенный вариант описываемого метода — использование фагов с гибридным иммунитетом [16] для определения направления транскрипции клонированных генов. Такие фаги были сконструированы, например, из левой половины области ? imm и правой половины области imm 434, что позволяет независимо регулировать промоторы PL и PR. Кроме того, внесение амбер-мутации в ген N дает возможность регулировать транскрипцию с PL с помощью супрессирующих и несупресси-рующих клеток-хозяев. Экспрессию генов, клонированных так, чтобы они транскрибировались под контролем PL, можно изучать обычным методом заражения облученных хозяйских клеток. Благодаря антитерминирующим свойствам белка N транскрипция в супрессирующем хозяине пройдет через все клонированные гены, если только в их составе нет очень сильного терминатора. Поскольку экспрессия этих генов будет увеличиваться или уменьшаться под действием мощной транскрипции фага ? [17], сравнение экспрессии клонированных генов в супрессирующих и несупрессирующих клетках-хозяевах позволяет определить направление транскрипции каждого гена. Хотя с такими фагами часто трудно работать, этот подход был с успехом использован в ряде исследований ? [15, 18, 19].

3. Система мини-клеток

3.1. Введение

Клетки Е. coli, несущие две мутации, min А и min В, делятся асимметрично, так что примерно каждое второе деление приводит к образованию небольшой «безъядерной» клетки [20]. Эти мини-клетки, способные синтезировать ДНК, РНК и белок, можно отделить от более крупных жизнеспособных клеток дифференциальным центрифугированием в градиентах сахарозы. Если штамм, продуцирующий мини-клетки, содержит небольшие многокопийные плазмиды, большинство мини-клеток будут содержать по законам теории вероятности хотя бы одну молекулу плазмиды и не будут содержать бактериальную хромосому. Такие мини-клетки синтезируют кодируемые плазмидой белки в течение длительного времени практически в тех же

200

Глава 6

условиях, что и внутри бактериальной клетки. В обзоре [21] подробно рассмотрены свойства мини-клеток, а также мутантов, продуцирующих мини-клетки, полученных из различных видов бактерий.

3.2. Материалы и штаммы

Материалы и штаммы, используемые для системы мини-клеток, перечислены в табл. 9.

Таблица 9. Бактериальный штамм и растворы, необходимые для приготовления системы мини-клеток

Бактериальный штамм

Е. coli DS410 (разд. 3.3), содержащий необходимые плазмиды Растворы

Питательный бульон1

Антибиотики для селекции плазмидных маркеров Минимальная среда М9

Минимальная среда М9, содержащая 20% (вес/объем) сахарозы Минимальная среда М9, содержащая 30% (по объему) глицерола 10,5%-ная среда для включения метионина (вес/объем) (фирмы Diico) [35 5]-метионин (10 мкКи/мкл; 1000 Ки/ммоль) L-метионин (8 мг/мл) Бактериальный буфер1

Буфер для нанесения на гель для проведения электрофореза с ДСН1 1 Составы сред и буферных растворов даны в табл. 3.

3.3. Штамм Escherichia coli DS410—продуцент мини-клеток

Первоначально был выделен штамм— продуцент мини-клеток Е. coli Р678-54 (его также обозначают ? 925) [20] с генотипом F- min A min В thr leu thi ara lac Y gal trial A xyl mil ton A rps L sup E. Впоследствии Дуган и Шеррат [22] выделили его производное DS 410 с генотипом thr+ leu+ mal+ lac+ sup0, которое в настоящее время широко используется для получения мини-клеток.

3.4. Подходящие плазмиды

Все изученные плазмиды, по-видимому, попадают в мини-клетки. Малокопийные плазмиды, например pSClOl, сегрегируют с высокой эффективностью [23]. В мини-клетках обнаруживаются даже такие крупные конъюгативные плазмиды, как F-фактор, хотя в подобных случаях сегрегация не всегда происходит достаточно эффективно '.[21]. Выделение плазмид и трансформацию хозяина — продуцента мини-клеток проводят так, как описано в табл. 10 и 11 соответственно.

Прежде чем производить очистку мини-клеток, следует приготовить непрерывные градиенты сахарозы 10—30% (вес/объ-

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

20!

Таблица 10. Выделение плазмидной ДНК1,

1. Вырастите ночную культуру штамма бактерий, содержащего плазмиду, в питательном бульоне.

2. Перенесите 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пробирку и осадите клетки центрифугированием в течение 1 мин.

3. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в 75 мкл буфера СТЭТ.

4. Добавьте 6 мкл раствора лизоцима (10 мг/мл) и быстро перемешайте.

5. Поместите пробирку в кипящую водяную баню на 1 мин.

6. Отцентрифугируйте на микроцентрифуге 10 мин, чтобы осадить комплекс хромосомной ДНК с белками.

7. Перенесите супернатант в чистую пробирку и добавьте равный объем изопропанола. Оставьте на 10 мин при —70 °С или на 1 ч при — 20 °С, чтобы осадить нуклеиновые кислоты.

8. Отцентрифугируйте 10 мин в микроцентрифуге, чтобы осадить нуклеиновые кислоты.

9. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 мкл 0,3 ? ацетата натрия, рН 5,6. Добавьте 0,3 мл" абсолютного этанола, а затем осадите нуклеиновые кислоты, как описано в пп. 7 и 8.

10. Отбросьте супернатант и высушите осадок под вакуумом.

11. Ресуспендируйте осадок в 30 мкл 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА.

12. Храните при 4 °С до использования; 10 мкл этого препарата должно хватить для эффективной трансформации (см. табл. 11).

1 Методы выделения небольших количеств плазмид впо

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2020)