нить УФ-повреж-денные клетки, лизируют во время последующей инкубации в течение ночи в присутствии ампициллина (30 мкг/мл) или D-циклосерина (100 мкг/мл). Кроме того, столь продолжительная инкубация приводит к деградации поврежденной хромосомной ДНК.

3. Если используется р/гг+-штамм, который способен репари-ровать УФ-индуцированные повреждения путем фотореактивации, сразу после облучения следует завернуть пробирки в алюминиевую фольгу и держать их закрытыми все время, пока проводятся операции, описанные в пп. 4 и 5.

4. После лизиса жизнеспособных растущих клеток оставшиеся клетки ресуспендируют в минимальной среде М9. Для того чтобы восполнить запасы аминокислот и таким образом увеличить эффективность синтеза белка, можно добавить вереду на стадии 9 смесь для включения метионина (фирмы Difco).

5. После мечения кодируемых плазмидой белков [35S]-Me-тионином клетки инкубируют в присутствии немеченого метионина для завершения синтеза полипептидов и подготавливают к электрофорезу в ПААГ с ДСН.

14·

212

Глава 6

Таблица 16. Мечение кодируемых плазмидой белков в макси-клетках1

1. Вырастите ночную культуру штамма2 для макси-клеток (предварительно трансформированного необходимой плазмидой) при 37 "С в минимальной среде, содержащей казаминовые кислоты.

2. Разведите культуру в 20 раз минимальной средой, содержащей казаминовые кислоты. Растите при 37 °С до Л45о = 0,5.

3. Перенесите 3 мл культуры в стерильную чашку Петри диаметром 5 см. Облучите УФ-светом с длиной волны 254 нм (доза 1,5 Дж/м2), помешивая, чтобы не осталось необлученных клеток.

4. Перенесите 2 мл облученной культуры в стерильную пробирку и проинкубируйте 1 ч при 37 °С на качалке.

5. Добавьте ампициллин3 до концентрации 30 мкг/мл и проинкубируйте культуру на качалке 16—24 ч при 37 °С.

6. Перенесите 1 мл культуры в стерильную микроцентрифужную пробирку и соберите клетки центрифугированием (2 мин на микроцентрифуге). Отбросьте супернатант.

7. Ресуспендируйте осадок клеток в минимальной среде М9 и снова соберите клетки центрифугированием, как в п. 6.

8. Повторите п. 7.

9. Ресуспендируйте клетки в 0,5 мл минимальной среды М9, содержащей 30 мкг/мл ампициллина. Добавьте 3 мкл 10,5%-ной среды (вес/объем) для включения метионина (фирмы Difco).

10. Проинкубируйте 1 ч при 37 °С.

11. Добавьте 25 мкКи [35 5]-метионина и проинкубируйте 1 ч при 37 °С.

12. Добавьте 10 мкл немеченого L-метионина (8 мг/мл) и проинкубируйте еще 5 мин.

13. Соберите клетки центрифугированием (микроцентрифуга, 2 мин). Отбросьте супернатант.

14. Ресуспендируйте клетки в 50 мкл бактериального буфера и добавьте 50 мкл буфера с ДСН для нанесения на гель для электрофореза. Погрейте 3 мин в кипящей водяной бане.

15. Нанесите 25 мкл пробы на пластинку ПААГ с ДСН4. Остаток храните при — 20 °С.

16. После электрофореза проведите радиоавтографию или флюорографию геля для выявления меченых белков4.

? Составы сред и буферных растворов даны в табл. 3 и 15.

2 Подходящие штаммы описаны в табл. 15. „.„„к,,™™ = Если плазмида кодирует ?-лактамазу, следует использовать другие антибиотики

(см. разд. 4.5). „

4 Подходящие методики можно найти в работе

На рис. 7 представлены примеры кодируемых плазмидой белков, помеченных в макси-клетках.

4.5. Возможные проблемы

Если наблюдается заметное включение [35S]-метионина в белки, не кодируемые плазмидой, возможно, придется увеличить дозу УФ-облучения, чтобы произошла более сильная деградация хромосомной ДНК. Однако на практике дозу можно варьировать в широких пределах без изменения степени деградации ДНК. Об эффективности облучения можно судить, определив число жизнеспособных клеток после посева на чашку

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

213

(оно должно быть менее 20 клеток на 1 мл в случае высокочувствительного штамма CSR603). Если взять штамм, у которого отсутствуют только гесЛ-зависимые пути репарации, можно использовать дозы до 40 Дж/м2 [32, 34]. Если облученная культура все-таки остается загрязненной растущими клетками (табл. 15), можно добавить ампициллин до концентрации 30 мкг/мл при условии, что плазмида не кодирует ?-лактамазу (продукт гена bla). Если же плазмида несет этот ген, можно использовать D-циклосерин (100 мкг/мл). Еще один альтернативный путь состоит в добавлении ?-лактамного антибиотика, относительно устойчивого к действию ?-лактамазы, например цефуроксима [35] или ампициллина и клавулановой кислоты [36].

5. Соответствие между генами и их продуктами

После того как белки, кодируемые плазмидой или фагом, идентифицированы с помощью одной из систем in vivo, описанных выше, можно применить различные подходы, чтобы соотнести отдельные клонированные гены с определенными белковыми полосами.

1. Можно субклонировать небольшие фрагменты, несущие исследуемый ген, в исходной плазмиде или фаге и изучить их в системе экспрессии. Кроме того, очищенные фрагменты можно использовать в качестве матриц в системах экспрессии in vitro, описанных в гл. 7.

2. Можно клонировать мутантный аллель и сравнить его с аллелем дикого типа. Экспрессию амбер-мутанта можно исследовать в супрессирующем и несупрессирующем хозяевах; миссенс-мутация может изменить заряд белка и его подвижность при двумерном гель-электрофорезе.

3. Можно получить мутантную плазмиду с помощью транс-позонов. Внедрение транспозона в исследуемый ген приведет к тому, что синтез РНК будет преждевременно терминирован или не будет идти совсем, хотя следует иметь в виду, что транспозон может оказывать полярное действие.

4. При работе с фагом ? можно вместо субклонирования фрагментов выделить ряд делегированных производных фага. Это легко сделать, если высеять фаг на агар, содержащий ЭДТА [37].

5. Наиболее четкие результаты можно получить, если сравнить нуклеотидную последовательность данного гена с аминокислотной последовательностью меченого белка. Частичное определение аминокислотной последовательности можно провести на меченом белке, вырезанном из ПААГ [38].

214

Глава 6

Если все-таки для гена, который несет плазмида или фаг, не удается найти соответствующий продукт, это можно объяснить целым рядом причин. Некоторые из них приведены ниже.

1. Интересующий нас белок не содержит метионина. В этом случае можно использовать имеющийся в продаже i[35S] -цистеин, хотя он и не является часто встречающейся в белках аминокислотой. Можно также использовать [14С]-лейцин или смесь [3Н]-аминокислот с высокой удельной радиоактивностью.

2. Белок весьма нестабилен и деградирует до его идентификации с помощью электрофореза в ПААГ. Чтобы предотвратить возможную деградацию, в среду перед лизисом клеток можно добавить какой-нибудь ингибитор протеаз, например PMSF. Может помочь также весьма кратковременное мечение, например в течение 5 мин или еще быстрее; тогда постоянный синтез более стабильных белков не помешает выявлению продукта исследуемого гена. Другая возможность — система синтеза in vitro Зьюби, описанная в гл. 7, так как нестабильные в условиях in vivo пептиды в этой системе, по-видимому, более устойчивы.

3. Ген имеет слишком слабый промотор или утрачивает свой промотор при клонировании. При клонировании в фаге ? можно попробовать использовать сильный промотор PL (разд. 2.7 и 2.8). Если ген клонирован в плазмиде, сильный промотор может быть введен с помощью стандартных методов получения рекомбинантных ДНК.

4. Белок агрегирует при электрофорезе и в результате не проникает в разделяющий гель. Это может произойти с очень гидрофобными белками. Иногда агрегации препятствует растворение белков в буфере с ДСН для нанесения образцов при 37 °С вместо 100 °С )[39, 40].

Благодарности

Эта работа частично финансировалась MRC Project Grant Award № G8203714CB.

Литература

1. Ptashne ?. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57, 306 (1966).

2. Jaskunas S. R„ Lindahl L., Nomura M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 6 (1975).

3. Brammar W. J. In: Genetic Engineering, vol. 3, Williamson R. (ed.), Academic Press Inc., London, p. 53, 1982.

4. Koshland D., Botstein D. Cell, 20, 749 (1980).

5. Репе J. J., Murr P. C, Barrow-Carraway J. J. Virol., 12, 61 (1973).

6. Miller J. H. Experiments in Molecular Genetics, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1972.

Прокариотические системы экспрессии генов in vivo

215

7. Davis R. W., Botstein D., Roth J. R. Advanced Bacterial Genetics, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1980.

8. Yamamoto K. R., Alberts В. M., Benzinger R., Lawhorne L., Treiber G. J. Virol, 40, 734 (1970).

9. Englesberg E., Wilcox G. Annu. Rev. Genet., 8, 219 (1974).

10. Hames B. D. In: Gel Electrophoresis of proteins: A Practical Approach, Ha-mes B. D. and Rickwood D. (eds.), IRL Press Ltd., Oxford, p. 1, 1981.

11. Murialdo H., Siminovitch L. In: The Bacteriophage Lambda, Hershey A. D. (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, ? 711, 1971.

12. Laskey R. ?., Mills A. D. Eur. J. Biochem., 56, 335 (1975).

13. Levine ?., Bailone ?., Devoret R. J. Mol. Biol., 131, 655 (1979).

14. Hedgpeth J., Ballivet M., Eisen H. Mol. Gen. Genet., 163, 197 (1978).

15. Lutkenhaus J. F., Wu H. C. J. Bacteriol., 143, 1281 (1980).

16. Brammar W. J. Biochem. Soc. Trans., 5, 1633 (1977).

17. Ward D. F., Murray N. E. J. Mol. Biol., 133, 249 (1979).

18. Murray N. E., Kelley W. S. Mol. Gen. Genet., 175, 77 (1979).

19. Wilson G. G., Murray N. E. J. Mol. Biol., 132, 471 (1979).

20. Adler ?. I., Fisher W. D., Cohen ?., Hardigree A. A. Proc. Natl Acad Sci. USA, 57, 321 (1967).

21. Frazer A. C, Curtiss R. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 69, 1 (1975).

22. Dougan G., Sherratt D. Mol. Gen. Genet., 151, (1977).

23. Meagher R. В., Та» R. С, Betlach ?., Boyer ?. W. Cell, 10, 521 (1974)

24. Holmes D. S., Quigley M. Anal. Biochem., 114, 193 (1981).

25. Birnboim H. C, Doly J. Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979).

26. Dagert M., Ehrlich S. D. Gene, 6, 23 (1979).

27. Morrison D. A. In: Methods in Enzymology, vol. 68, Wu R. (ed.), Academic Press Inc., London and New York, p. 326, 1979.