28. Levy S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 2900 (1975).

29. Reeve J. In: Methods in Enzymology, vol. 68, Wu R. (ed.), Academic Press Inc., London and New York, p. 493, 1979.

30. Clement J. M., Perrin D., Hedgpeth J. Mol. Gen. Genet, 185, 302 (1982).

31. Hanawalt P. C, Cooper P. K., Ganesan A. K., Smith C. A. Annu. Rev. Biochem., 48, 783 (1979).

32. Sancar ?., Wharton R. P., Seltzer S., Kacinski В. M., Clarke N. D., Rupp W. D. J. Mol. Biol., 148, 45 (1981).

33. Sancar ?., Hack A. M., Rupp W. D. J. Bacterid., 173, 692 (1979).

34. Isberg R. R., Lazaar A. L., Syvanen M. Cell, 30, 883 (1982).

35. Neu H. C, Fu K. P. Antimicrob. Agents Chemother., 13, 657 (1978).

36. Reading C, Cole M. Antimicrob. Agents Chemother., 11, 852 (1977)

37. Stoker N. G., Broome-Smith J. K., Edelman ?., Spratt B. G. J. Bacteriol 155 847 (1983).

38. Hedgpeth J., Clement J. M., Marchal C, Perrin D., Hofnung M. Proc Natl Acad. Sci. USA, 77, 2621 (1980).

39. Teather R. M., Muller-Hill В., Abrutsch U., Aichele G, Overath ? Mol Gen Genet., 159, 239 (1978).

40. Stoker N. G., Pratt J. M., Spratt B. G. J. Bacteriol., 155, 854 (1983).

ГЛАВА 7

СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ ТРАНСКРИПЦИИ — ТРАНСЛЯЦИИ

Дж. Пратт

1. Введение

В то время как у эукариот процессы транскрипции и трансляции часто изучают по отдельности, у прокариот эти сопряженные процессы, как правило, исследуют вместе. Неудачные попытки исследования систем трансляции, зависящих от бактериальных мРНК, объясняются главным образом двумя причинами. Во-первых, из бактерий (обычно используют для исследований Е. coli) трудно выделить интактную мРНК. из-за большого количества эндогенной нуклеазы, деградирующей мРНК во время выделения. Во-вторых, трансляция бактериальных мРНК обычно начинается, когда еще продолжается транскрипция (т. е. транскрипция и трансляция тесно сопряжены), тогда как у эукариот в обычных условиях мРНК не транслируется до завершения ее синтеза. Возможно, полностью синтезированные молекулы бактериальных мРНК не способны связываться с рибосомами из-за особенностей вторичной структуры в области сайта инициации. ДНК-зависимая бесклеточная система синтеза белка с сопряжением транскрипции и трансляции позволяет решить обе проблемы. Две такие наиболее широко используемые системы описаны в настоящей главе: предынкубированный экстракт Е. coli S30, предложенный Зью-би [1, 2], и фракционированная система Голда и Швейгера [3].

2. Получение бесклеточной системы Зьюби

2.1. Введение

Бесклеточная система Зьюби [1, 2] представляет собой неочищенный экстракт Е. coli, содержащий все ферменты и факторы, необходимые для транскрипции и трансляции; в этот экстракт добавляют аминокислоты, систему регенерации энергии и некоторые кофакторы. Со времени первых публикаций метод претерпел небольшие изменения ?[4, 5] и все шире используется в настоящее время. В последующих разделах подробно описана модифицированная методика, и если ей тщательно следовать, то получение активных экстрактов гарантировано.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 217

Таблица 1. Приборы и оборудование, которые необходимо обработать ДЭПК и автоклавировать

4 пятилитровых колбы с ватными пробками

6 однолитровых колб с завинчивающимися крышками

16 полипропиленовых центрифужных пробирок на 50 мл с крышками

6 стаканов на 25 мл

4 мерных цилиндра на 100 мл

4 мерных цилиндра на 50 мл

6—10 колб Мак-Картни

3—4 больших магнита для магнитной мешалки

20—30 пастеровских пипеток

3 колбы Бюхнера на 100 мл

1 резиновая пробка для колбы Бюхнера

3 шпателя разных размеров

1 пестик гомогенизатора

2.2. Оборудование и реактивы

Всего для приготовления растворов понадобится 16 л воды. Обработайте воду диэтилпирокарбонатом (ДЭПК), чтобы инак-тивировать возможную рибонуклеазную активность. Для этого медленно добавьте под тягой при помешивании 1 мл ДЭПК на 1 л дистиллированной воды. Продолжайте перемешивание в течение 1 ч, затем автоклавируйте воду и храните ее при 4 °С.

Посуда и другое оборудование, необходимое для стандартного приготовления системы Зьюби, перечислены в табл. 1. Обработайте всю стеклянную посуду, центрифужные пробирки и пластиковые шланги ДЭПК. Для этого наполните или погрузите их в воду, в которой непосредственно перед обработкой был добавлен ДЭПК (1 мл на 1л воды). Удалите раствор и немедленно автоклавируйте оборудование. Отрежьте 8—12 кусков диализной трубки диаметром 2,5 см и длиной 30—40 см и прокипятите их 20 мин в 0,1 м ЫаНСОз, 10 мМ ЭДТА. Вылейте раствор и повторите процедуру 1—2 раза, пока раствор не перестанет быть коричневым. Тщательно ополосните трубки в воде, обработанной ДЭПК, и храните в стерильной воде с ДЭПК при + 4°С не дольше 1—2 дней1.

Реактивы, необходимые для стандартного приготовления системы Зьюби, перечислены в табл. 2. Там же указаны фирмы, у которых мы обычно покупаем реактивы; вполне возможно, что им не уступают реактивы и других фирм. Приготовьте исходные растворы, перечисленные в табл. 3 и 4, используя воду, обработанную ДЭПК. Доведите рН щелочных растворов до требуемого значения уксусной кислотой (ледяной или разведенной в 10 раз

1 Обработанные диализные трубки можно хранить в 30%-ном этаноле в течение многих месяцев. Перед употреблением их достаточно ополоснуть в растворе для диализа. — Прим. перев.

218

Глава 7

Таблица 2. Реактивы, необходимые для приготовления системы Зьюби

Максималь-

Реактив Фирма1 ная потреб-

ность

Ацетат аммония (Analar) BDH Chemical Co. 5 г

Глюкоза (Analar) То же 500 г

КН2РО4 (Analar) » 200 г

К2НРО4 (Anaral) » 1 кг

Ацетат кальция Fisons Scientific Appara- 5 г

tus

Ледяная уксусная кислота То же 100 мл

Ацетат магния-4Н20 (Anaral) » 500 г

ПЭГ-6000 » 5 г

Ацетат калия (SLR) » 5 г

Аминокислоты (набор из 20 обыч- Sigma Chemical Co. 1 г (всего) < ных аминокислот; табл. 4)

АТР (Na2) из мышц лошади, сво- То же 2 г бодный от ванадия

3', 5'-сАМР (Na) » 100 мг

СТР (Na) » 100 мг

ДЭПК » 25 мл

DL-ДТТ » 5 г

Фолиновая кислота (лейковорин » 100 мг кальция)

GTP (Na) » · 100 мг

2-Меркаптоэтанол » 20 мл

Фосфоенолпируват (К) » 2 г

Пируваткиназа из мышц кролика » 0,5 мл (2000 ед./мл)

Тиамин-НС1 » 100 мг

Трис » 500 г

Транспортная РНК (деацилирован- » 100 мг ная тРНК Е. coli)

UTP (Na) из дрожжей » 100 мг

[35S]-метионин (1000 Ки/ммоль; Amersham International 1 мКи ~ 10 мкКи/мкл)

Дрожжевой экстракт Oxoid 100 г

1 Вполне возможно, что годятся реактивы, купленные и у других фирм.

водой, обработанной ДЭПК), а кислых — 2 ? трис. Разведенную уксусную кислоту и трис предварительно автоклавируйте. Налейте исходные растворы в стеклянную посуду, обработанную ДЭПК, автоклавируйте и храните, как указано в табл. 3. Наконец, приготовьте из этих исходных растворов смесь низкомолекулярных компонентов (НМ-смесь), как описано в табл. 5.

2.3. Получение клеток

Если для идентификации продуктов генов используют в качестве ДНК-матрицы плазмиды или фаг ?, то в качестве источника ЭЗО-экстракта лучше всего подходит штамм Е. coli MRE600,.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 219

Таблица 3. Исходные растворы для системы Зьюби

Исходный раствор Объем, мл Потребность Температура хранения, °С

в автоклави-

ровании Смесь аминокислот А (табл. 4) 5 Нет —20

Смесь аминокислот Б (табл. 4) 5 » »

38 мМ АТР, рН 7,0 20 » »

88 мМ СТР ) 1

88 мМ GTP рН 7,0 »

88 мМ UTR J 1

50 мМ 3', 5'-сАМР, рН 7,0 > »

0,10 ? ДТТ 100 > »

0,55 ? ДТТ 5 » »

Фолиевая кислота (2,7 мг/мл) 1 » »

0,1 ? ацетат магния 10 Да 4

1,4 ? ацетат магния 500 » »

3,0 ? ацетат магния 100 » »

Метионин (8 мг/мл) 1 Нет —20

0,42 ? фосфоенолпируват, рН 7,0 10 » »

40%-ный ПЭГ-6000 10 Да »

6,0 ? ацетат калия 500 » 4

Исходный раствор солей:

1,4 ? ацетат аммония ]

2,8 ? ацетат калия > 10 » —20

0,38 ? ацетат кальция J

тРНК (17,4 мг/мл) 1 Нет »

ТА-буфер (10 мМ трис-ацетат, 500 Да 4

рН 7,0) 500

1,0 ? трис-ацетат, рН 8,2 » »

2,2 ? трис-ацетат, рН 8,2 100 » »

ТЭ-буфер (10 мМ трис-HCl, 1 мМ 500 » »

ЭДТА, рН 7,5)

так как он не содержит основную рибонуклеазную активность Е. coli и его легко выращивать. Для исследований линейных молекул ДНК рекомендуется использовать штамм гесВи (разд. 5.1.1). Для специальных работ, например для изучения регуляции экспрессии генов (разд. 4.4), экстракт можно получить из любого мутантного штамма.

1. Приготовьте 10 л неполной богатой среды, как указано в табл. 6.

2. Добавьте 800 мл 25%-ной (вес/объем) глюкозы и 100 мл 0,1 ? ацетата магния (оба раствора должны быть автоклавиро-ваны).

3. Предынкубируйте среду при нужной температуре (обычно при 37 °С, в случае температурочувствительных штаммов — при 30°С; разд. 5.1.1).

4. Инокулируйте среду ночной культурой нужного штамма, так чтобы Л45о = 0,07.

220

Глава 7

Таблица 4. Приготовление смесей аминокислот

Аминокислота

Навески, мг

смесь А смесь Б

22 25

. 53 58

33 36

33 37

30 33

37 41

37 40

19 21

48 53

33 36

33 36

46 50

37 _

31 34

29 32

26 29

30 33

51 56

45 50

29 32 *

Алании Аргинин-НС1 Аспарагин

Аспарагиновая кислота Цистеин

Глутаминовая кислота Глутамин Глицин Гистидин-НС1 Изолейцин Лейцин Лизин Метионин Фенилаланин Пролин Серин Треонин Триптофан Тирозин В алии

Для приготовления смесей растворите перечисленные аминокислоты в 5 мл воды (конечный объем). Конечная концентрация аминокислот в смеси А —50 мМ, а в смеси Б —55 мМ.

Таблица 5. Приготовление смеси низкомолекулярных компонентов (НМ-смеси) Исходный раствор Объем, мкл Конечная концентрация в реакционной смеси

2,2 ? трис-ацетат, рН 8,2 0,55 ? ДТТ 38 мМ АТР, рН 7,0 88 мМ СТР ) 88 мМ GTP РН 7,0

88 мМ UTP J