Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

к описано в табл. 10.

Синтез белка должен идти с высокой скоростью в течение по крайней мере 40 мин. Результат типичного эксперимента приведен на рис. 3.

3. Получение бесклеточной системы Голда и Швейгера

3.1. Введение

Другой способ получения бесклеточной системы транскрипции— трансляции был описан Голдом и Швейгером [3]. Он включает фракционирование различных компонентов клеток Е. coli и последующую реконструкцию активной системы. Эта система используется так же широко, как и система Зьюби (разд. 2).

3.2. Оборудование и реактивы

Подготовьте стерильную стеклянную посуду, центрифужные пробирки и диализные трубки. Приготовьте исходные растворы, перечисленные в табл. 11, и храните их при —20 °С (кроме буфера А). При этой температуре растворы можно хранить 2—

3 мес.

3.3. Получение клеток

Выбор штамма Е. coli определяется теми же соображениями, что и в случае получения БЗО-экстракта для системы Зьюби; читатель может вернуться к ним в разд. 2.3. Для изучения препаратов линейных ДНК можно использовать штамм гесВ (разд. 5.1.2).

1. Приготовьте 10 л богатой среды, как описано в табл. 12.

2. Предынкубируйте среду при нужной температуре и про-инокулируйте ее ночной культурой соответствующего штамма Е. coli, чтобы Л450 было равно 0,07.

3. Проинкубируйте клетки при 37 °С с интенсивной аэрацией (встряхиванием), пока Л450 не достигнет 0,6—0,7 (ранняя логарифмическая фаза; концентрация клеток ~2·108 клеток/мл).

4. Соберите клетки центрифугированием в течение 15 мин при 10OOOg- при 4°С.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 231 Таблица 11. Исходные растворы для системы Голда и Швейгера'

Потребность Температура

Исходный раствор Объем в автоклави- хранения, °С

ровании

---—*

Буфер А:

10 мМ трис-HCl, рН 7,5 10 мМ ацетат магния 22 мМ ацетат аммония 1 мМ ДТТ

Аминокислоты (5 мМ каждая)2

0,2 ? АТР3

0,2 ? СТР3

0,2 ? GTP3

0,2 ? UTP3

1,0 ? ДТТ

6 мМ фолиновая кислота

0,12 ? ацетат магния

1,0 ? фосфоенолпируват

2,0 ? ацетат калия

тРНК (деацилированная тРНК

Е. coli, 10 мг/мл)

1,0 ? трис-ацетат, рН 8,0

Радиоактивная аминокислота4

2 л Да

5 мл Нет

2 мл »

0,5 мл »

0,5 мл »

0,5 мл

2 мл

0,5 мл »

10 мл Да

5 мл Нет

10 мл Да

1 мл Нет

20 мл Да

4

—20

1 Для приготовления этой системы можно использовать те же реактивы, что и для системы Зьюби (т?бл. 2). ? ^

2 В смесь входят все 20 обычных аминокислот, кроме той, которая использ}ется в качестве радиоактивного предшественника.

3 рН этих растворов перед использованием не подводят (табл. 13).

4 Обычно используют [Щ]-лейции (5 мкКи/мкл; 150 Ки/ммоль) или [35S]-метионин (10 мкКн/мкл; 1000 Ки/ммоль).___

Таблица 12. Приготовление богатой среды

проавтоклавируйте растворы I, II и III по отдельности:

100 238 0,33 0,10 10,0 3,0

г

мл г г г г

Приготовьте

Раствор I

Бакто-пептон Глицерол СаС12 Желатина NH4C1

MgS04-4H20

Дистиллированная вода до 500 мл

Раствор II

Растворите 50 г глюкозы в 500 воды

Раствор III

К2НР04 КН2Р04

Дистиллированная вода до 300 мл

Чтобы приготовить богатую среду, смешайте проавтоклавированные растворы I, II и III и доведите объем до 10 л стерильной дистиллированной водой.

мл дистиллированной

90,0 г 34,5 г

232

Глава 7

5. Промойте клетки 250 мл буфера А (табл. 11), приготовленного перед опытом и хранящегося при 4 °С. Повторите такую промывку еще дважды и определите сырой вес клеток.

6. Храните клетки в виде осадка в жидком азоте, пока они не понадобятся.

3.4. Получение бесклеточного экстракта

Если условия не указаны, проводите все операции при 4 °С.

1. Промойте гомогенизатор Sorvall Omnimix и достаточное количество стеклянных шариков (40 г на 10 г клеток) стерильной водой и храните их при 4 °С. Желательно сделать это за день до эксперимента. Голд и Швейгер использовали стеклянные шарики Superbrite 100 (Minnesota Mining Со). Кроме того, приготовьте колонку (1X10 см), содержащую 5 г ДЭАЭ-целлю-лозы (Serva), промойте ее 50 мл буфера А (табл. 11) и храните при +4°С.

2. Смешайте 10 г клеток с 10 мл холодного буфера А и 40 г промытых стеклянных шариков.

3. Разрушьте клетки в Sorvall Omnimix на максимальной скорости в течение 3 мин.

4. Отцентрифугируйте препарат 5 мин при 16 000 g", чтобы удалить стеклянные шарики.

5. Отцентрифугируйте супернатант 20 мин при 154 000 g\ Отберите супернатант.

6. Отцентрифугируйте супернатант 90 мин при 198 000 g, чтобы осадить рибосомы. Оставьте супернатант во льду до стадии 10 и займитесь осадком рибосом.

7. Ресуспендируйте рибосомы примерно в 10 мл буфера А и проинкубируйте их 90 мин при 37 °С.

8. Отцентрифугируйте суспензию 10 мин при 12 000 отбросьте осадок и снова отцентрифугируйте супернатант 90 мин при 198 000 g, чтобы еще раз осадить рибосомы.

9. Ресуспендируйте рибосомы в буфере А в концентрации 100 мг/мл (исходя из того, что этой концентрации соответствует Л2бо=1480) и храните суспензию в аликвотах в жидком азоте, пока она не понадобится.

10. Нанесите супернатант, полученный на стадии 6, на приготовленную колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (п. 1) и промойте колонку 50 мл буфера А.

11. Элюируйте белок с колонки ДЭАЭ-целлюлозы буфером А, содержащим 0,25 ? хлористый аммоний, определяя во фракциях /4280· Объедините фракции, соответствующие белковому пику.

12. Разделите элюированный белок на аликвоты и храните их в жидком азоте.

Рибосомы служат источником факторов инициации. Они мо-

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 233

гут храниться в жидком азоте до 3 мес. Белковая фракция содержит ферменты, активирующие аминокислоты, факторы элонгации ? и G и большую часть ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Концентрация белка в этой фракции должна составлять 8—10 мг/мл; при хранении в жидком азоте белковая фракция стабильна в течение по крайней мере 3 мес.

3.5. Оптимизация системы

Как и в случае системы транскрипции — трансляции in vitro Зьюби (разд. 2.5.2), в системе Голда и Швейгера необходимо определить оптимальную концентрацию ионов магния. Обычно

Таблица 13. Инкубационная смесь для системы Голда и Швейгера1

1. Приготовьте следующие смеси:

Смесь I:

1,0 ? трис-ацетат, рН 8,0 2,0 ? ацетат калия Аминокислоты (5 мМ каждая) 1,0 ? ДТТ

Вода до конечного объема 2 мл

Смесь II:

0,2 ? АТР 0,2 ? СТР 0,2 ? GTP 0,2 ? UTP

1,0 ? фосфоенолпируват Добавьте раствор КОН, чтобы довести рН до 6,5, и за тем добавьте воды до конечного объема 1,0 мл.

2. Для составления реакционной смеси смешайте исходные растворы в следующих соотношениях:

Исходный раствор Объем, мкл

Смесь I 20а

Смесь II 58

тРНК (10 мг/мл) 5

6 мМ фолиновая кислота 5

0,12 ? ацетат магния 5

Белковая фракция3 40

Рибосомы3 100

ДНК (100—600 мкг/мл)4 10

Радиоактивная аминокислота5 100

1 Состав исходных растворов приведен в табл. 11.

2 Остаток смесей I и II можно хранить в аликвотах при — 70 "С для дальнейшего использования.

3 Приготовление этих компонентов описано в разд. 3.4. При оптимизации системы их объемы можно варьировать в диапазоне ±50%.

4 Плазмидная ДНК (например, pBR325).

5 Обычно используют [3Н]-лейцин (5 мкКи/мкл, 150 Ки/ммоль) или [35S]-метионин (10 мкКи/мкл, 1000 Ки/ммоль).

0,50 мл 0,25 мл 0,40 мл 20 мкл

0,20 мл 50 мкл 50 мкл 50 мкл

0,40 мл

234

Глава 7

она составляет 11—15 мМ. Кроме того, следует поварьировать объемы рибосомной и белковой фракций, пока не будет достигнут оптимальный уровень синтеза. Для каждой из процедур оптимизации подготовьте инкубационные смеси путем смешивания растворов, перечисленных в табл. 13. Как и в системе Зьюби, в качестве матрицы в этих опытах лучше всего использовать ДНК какой-либо многокопийной плазмиды (разд. 2.5.1). После инкубации в течение 40 мин при 37 СС определите включение радиоактивной аминокислоты в белок путем осаждения ТХУ, как описано в табл. 10, и проанализируйте продукты инкубации электрофорезом в ПААГ —ДСН (разд. 2.5.2).

Найдя оптимальный состав инкубационной смеси, следует определить кинетику системы транскрипции — трансляции, как было описано выше (2.5.3). Синтез белка должен идти с высокой скоростью в течение по крайней мере 40 мин.

3.6. Модификация основной методики

Многие исследователи вносили небольшие изменения в процедуру Голда и Швейгера. Подробнее познакомиться с этими изменениями и примерами можно в статьях [6, 7].

4. Использование в качестве матриц ДНК плазмид или фага ?

4.1. Экспериментальные подходы

Реакционные смеси, приготовленные по методу Зьюби (разд. 2.5) или Голда и Швейгера (разд. 3.5), позволяют исследовать в системе с нативной рекомбинантной ДНК в качестве матрицы любые гены, клонированные в плазмидных векторах или в фаге ?. Выделение плазмидной ДНК было описано выше (табл. 8), а методика для выделения ДНК фага ? дана в табл. 14. Выбор штамма Е. coli для получения бесклеточного экстракта определяется целями эксперимента: обычно для идентификации продуктов клонированных генов (разд. 4.2) и предшественников белков (разд. 4.3) используют штаммы MRE600; для изучения регуляции экспрессии генов более подходящими могут оказаться другие штаммы (разд. 4.4). Инкубацию проводят при оптимальных концентрациях ионов магния и экстракта, а затем полипептидные продукты характеризуют с помощью электрофореза в ПААГ —ДСН (разд. 2.5.2).

4.2. Идентификация продуктов клонированных генов

Сравнивая меченые полипептидные продукты, полученные в системе после добавления вектора клонирования (плазмиды или фага ?), с продуктами рекомбинантной ДНК, можно иден-

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 235

Таблица 14. Выделение фаговой ДНК

1. Выделите фаг, как описано в гл. 6, табл. 5, и очистите его центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности CsCl, как описано в гл. 6, табл. 7.

2. После центрифугирования отберите шприцем полоску фага и перенесите ее в силиконированную стеклянную центрифужную пробирку.

3. Добавьте РНКазу (2 мкг/мл) и оставьте при комнатной температуре на 30 мин.

4. Добавьте равн

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.10.2020)