рализации происходит экспрессия всех кодируемых плазмидой белков, а синтез ?-лактамазы идет в присутствии релаксированной матрицы даже более эффективно.

Таким образом, роль сверхспирализации в экспрессии генов остается совершенно неясной, и прежде чем сделать окончательные выводы, необходимы дополнительные исследования. Мы считаем, что сверхспирализация не обязательна для экспрессии в системах in vitro всех генов, кодируемых матрицей, и поэтому линейные фрагменты ДНК способны функционировать как матрицы. Можно ли использовать линейные ДНК при изучении факторов, участвующих в регуляции экспрессии генов,— вопрос спорный. В данном случае больше подходят кольцевые сверхспиральные матрицы, так как они лучше воспроизводят топологию ДНК in vivo.

5.3. Идентификация химерных белков

При клонировании фрагментов ДНК в плазмидных или фаговых векторах в результате соединения кодирующих последовательностей вектора и вставки могут возникать матрицы для химерных белков. Появление таких белков на электрофореграмме при анализе рекомбинантных ДНК в какой-либо из систем экспрессии генов in vivo (гл. 6) затрудняет интерпретацию результатов. Эту проблему можно решить с помощью системы экспрессии in vitro. Перед инкубацией ДНК расщепляют эндонуклеаза-

246

Глава 7

1 2

- 74 кДа

Рис. 9. Идентификация химерных белков. " Радиоавтография полипептидов, меченных [35S]-MeTHOHimoM, после электрофореза в 11%-ном ПААГ—ДСН. Полипептиды синтезировали in vitro в присутствии БЗО-экст-а. :,; * ракта из клеток MRE600. Дорожка 1 — i 5 мкг pLG310; дорожка 2 — 5 мкг pLQ310 после расщепления /:, <;RI. Плазмида pLG310 была получена путем лигирования ; fcoRI-фрагмента (6,4 kb), несущего dacC (структурный ген РВР6), с вектором PSF2124 (Со1Е1::ТпЗ). Ни pSF2124, ни ;S fcoRI-фрагмент по отдельности не кодируют белок с мол. массой 74 кДа. Этот белок образуется путем непрерывного счи-гывания через границу вектора и вставки; : поэтому его синтез чувствителен к расщеплению ?coRI. РВР6* и ?-lac* — предшест-:'. венники пенициллинсвязывающего "белка 6 и ?-лактамазы соответственно.

ми рестрикции, использованными для клонирования. При сравнении полипептидов после электрофореза в ПААГ—ДСН с набором белков, образующихся при экспрессии интактной ДНК [5], подвижность химерных белков всегда меняется при расщеплении ДНК (рис. 9).

5.4. Идентификация продуктов клонированных генов, сходных по размеру с белками, кодируемыми вектором

Большинство белков, кодируемых плазмидными векторами для клонирования, имеют мол. массу менее 35 кДа. Поэтому более крупные белки, кодируемые клонированной ДНК, легко идентифицировать, но меньшие белки могут быть замаскированы векторными белками со сходной молекулярной массой. На рис. 10 приведен анализ одного из плазмидных векторхш и его рекомбинантного производного, для которых спектры белков весьма сходны. Чтобы идентифицировать кодируемый вставкой полипептид, рекомбинантную плазмиду расщепили рестрик-

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — транслицни 247

Рис. 10. Идентификация продуктов клонированных генов, идентичных по размеру белкам, кодируемым вектором. Приведена радиоавтография полипептидов, меченных [355]-метионином, после электрофореза в 15%-ной ПААГ — ДСН. Синтез проводили в присутствии экстракта клеток Е. coli MRE600, Плазмида pKN410 — вектор, pLG5I0 —его рекомбинантное производное, содержащее ScoRI-фрагмент длиной 2,5 kb. Дорожка 1 — fcoRI-фрагмент pLG510, дорожка 2 —pLG510, дорожка 3 —pKN410. Белок с мол. массой 33 кДа и неизвестной функцией кодируется вектором, и его ген содержит fcoRI-сайт; ?-lac* — предшественник ?-лактамазы.

тазой EcoRl и клонированный фрагмент очистили с помощью электрофореза в агарозном геле. Когда его ввели в качестве матрицы в систему Зьюби, он детерминировал синтез одного белка с массой 32 кДа (рис. 10, дорожка 1). Этот белок был позднее идентифицирован как продукт гена envA. Белок с мол. массой 33 кДа (рис. 10, дорожка 3) — полипептид, который кодируется вектором pKN410, содержащим ?соЩ-сайт, и поэтому его нет среди продуктов, синтезированных на матрице рекомбинантной ДНК, но на его место попадает белок с мол. массой 32 кДа, кодируемый вставкой. Из-за этого возникла сложность в идентификации полипептидов, кодируемых клонированной ДНК, пока ее не выделили и не использовали как матрицу в отсутствие векторной ДНК.

248

Глава 7

5.5. Идентификация генов, клонированных со своими собственными промоторами

Поскольку в системе транскрипции — трансляции in vitro, модифицированной для использования линейных ДНК-матриц (разд. 5.1), можно анализировать ДНК вектора и вставки по отдельности, легко установить, клонирован ли тот или иной ген вместе со своим промотором (рис. 10). Если цель эксперимента — изучение регуляции экспрессии гена, то использование клонированным геном своего собственного промотора особенно важно. Ведь во многих экспериментах по клонированию инициация транскрипции происходит частично, а то и полностью, на одном из векторных промоторов.

MR ? 600

N138 re с В

is

1 За 2 '} 3 4 5 : 6 7 8 9 10

Рис. 11. Идентификация внутригенных и межгенных сайтов узнавания эндо-нуклеазами рестрикции. Радиоавтография полипептидов, меченных [35S]-Me-тионином, после электрофореза в 15%-ном ПААГ—ДСН. Полипептиды синтезировали в присутствии БЗО-экстракта из клеток E.coliMRE600 или N1387ecBts. Матрицей служила плазмида pBR325, расщепленная различными эндонуклеазами рестрикции. Дорожки 1 и 6 — pBR325; дорожки 2 и 7 — pBR325, расщепленная ?coRI; дорожки 3 и 8 — pBR325, расщепленная Pst\\ дорожки 4 и 9 — pBR325, расщепленная НШШ; дорожки 5 и 9 — контрольные пробы без ДНК. Обозначения: ?-lac* и CAT — предшественники ?-лактамазы и хлорамфениколацетилтрансфераза соответственно.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансляции 249

5.6. Идентификация сайтов рестрикции внутри генов и между генами

Модифицированные системы транскрипции — трансляции in vitro (разд. 5.1) позволяют легко идентифицировать сайты рестрикции внутри генов и между генами. Для этого достаточно обработать ДНК различными рестриктазами и проанализировать, на синтез каких полипептидов эта обработка не влияет, а синтез каких чувствителен к расщеплению ДНК той или иной эндо-нуклеазой рестрикции. Это позволяет картировать определенные полипептидные продукты с точностью до очень коротких фрагментов ДНК- На рис. 11 приведены результаты использования pBR325, расщепленной различными ферментами рестрикции, в качестве матрицы для транскрипции — трансляции in vitro. Синтез CAT чувствителен к расщеплению EcaRl (дорожка 7), а синтез ?-лактамазы чувствителен к расщеплению Pstl (дорожка 8). Белок устойчивости к тетрациклину в этих пробах не найден. На этом же рисунке приводится сравнение экстрактов из клеток гесВ+ и recBts и видно, что гесВ^-экстракт гораздо эффективнее в присутствии линеаризованной ДНК.

5.7. Анализ ДНК в гетерологичных системах

Мы исследовали ДНК грамположительной бактерии Staphylococcus aureus в БЗО-экстрактах, полученных из E.coli [5]. Эта ДНК весьма эффективно функционировала в системе транскрипции— трансляции с образованием ряда полипептидных продуктов. Однако число обнаруженных полипептидов превышало их количество, вычисленное на основании анализа последовательности ДНК [18]. Ту же плазмиду анализировали в штамме Bacillus subtilis — продуценте мини-клеток {В. subtilis — также грамположительная бактерия), и при этом синтезировалось гораздо меньше белков, чем в опытах in vitro [19, 20]. Вполне возможно, что на гетерологичной ДНК ДНК-зависимая РНК-полимераза Е. coli способна инициировать транскрипцию на участках, которые в норме не используются. Поэтому результаты, полученные на гетерологичных ДНК, следует интерпретировать с крайней осторожностью. Возможно, эту проблему удастся решить, когда будут ставить эксперименты на подобных системах транскрипции — трансляции из других видов бактерий. Такие системы уже получены из В. subtilis [21] и Streptomyces livi-dans (Rae, Cundliffe, личное сообщение).

5.8. Экспрессия эукариотических генов

Для того чтобы получить экспрессию эукариотического гена в Е. coli, он должен либо не иметь интронов, либо должен быть клонирован в виде кДНК; кроме того, его необходимо снабдить

250

Глава 7

прокариотическими сигналами экспрессии. Однако из-за различий в использовании кодонов между прокариотами и эукарио-тами экспрессия в Е. coli может оказаться неэффективной. В системах in vitro эту проблему можно решить, если изменить набор тРНК в реакционной смеси.

6. Сравнение систем транскрипции — трансляции in vitro

6.1. Достоинства и недостатки модифицированной системы Зьюби

6.1.1. Достоинства

1. Систему несложно получить и очень легко использовать.

2. БЗО-экстракт—неочищенный препарат, и в нем должно присутствовать большинство регуляторных факторов.

3. БЗО-экстракт можно хранить в жидком азоте несколько лет без всякой потери активности.

6.1.2. Недостатки

1. БЗО-экстракт может содержать остатки ДНК, которые способны служить матрицами и давать большое число фоновых полипептидов. Правда, обычно остаточное содержание ДНК ничтожно.

2. БЗО-экстракт содержит фрагменты мембран, хотя и не активных как акцепторы при биосинтезе мембранных белков [9].

6.2. Достоинства и недостатки системы Голда и Швейгера

6.2.1. Достоинства

1. Фракционирование на ДЭАЭ-целлюлозе обеспечивает почти полное освобождение системы от остатков ДНК, в результате чего система имеет крайне низкое фоновое включение.

2. Система Голда и Швейгера содержит, по-видимому, меньше эндогенных аминокислот, чем система Зьюби, что дает более высокое включение радиоактивных аминокислот.

6.2.2. Недостатки

1. Систему сложно получать и использовать.

2. Белковая фракция и рибосомы стабильны лишь в течение нескольких месяцев.

3. В ходе приготовления системы при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе могут быть утрачены некоторые важные белковые факторы.

Прокариотические бесклеточные системы транскрипции — трансля