Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

оисхождением образца и распределением требуемых полисом по размеру. Как правило, неочищенные постмитохондриальные супернатанты следует фракционировать в градиентах с концентрацией сахарозы 20—50%, чтобы свести к минимуму загрязнение полисом белками, диффундирующими из верхней части градиента. Если на градиент наносят уже очищенные полисомы, то такой проблемы не возникает.

• Для выделения полисом из мышц используют 0,25 ? NaCl или 0,25 ? КС1 '[11].

264

Глава 8

Таблица 8. Быстрое выделение полисом осаждением ионами магния [12]

1. Измельчите ткань и тщательно прогомогенизируйте ее в девяти объемах холодного буфера следующего состава:

25 мМ NaCl

5 мМ MgCl2

1 мг/мл гепарина

2% тритона Х-100

25 мМ трис-HCl, рН 7,5

2. Отцентрифугируйте гомогенат 5 мин при 27 OOOg и отберите супернатант.

3. Добавьте равный объем буфера для гомогенизации, содержащего 0,2 ? MgCl2, и проинкубируйте 1 ч при 4 °С.

4. Наслоите 8 мл этого препарата на 4 мл 1 ? сахарозы в 25 мМ NaCl, 0,1 ? MgCI2, 25 мМ трис-HCl, рН 7,5, и отцентрифугируйте 10 мин при 27 OOOg.

5. Отсосите и отбросьте супернатант и часть слоя сахарозы.

6. Ополосните стенки пробирки водой, отсосите воду и слейте остальной раствор сахарозы.

7. Дайте жидкости стечь с осадка полисом, протрите стенки пробирки фильт-

ровальной бумагой и ресуспендируйте полисомы в подходящем буфере.

эндогенных рибонуклеаз. Возможно и механическое дробление РНК при осаждении и ресуспендировании полисом, особенно если речь идет о длинных мРНК. Полисомный осадок могут загрязнять некоторые РНП-частицы неполисомной природы. Последние две проблемы можно решить, если выделять полисомы центрифугированием в градиенте сахарозы (табл. 7, вторая часть), а не дифференциальным центрифугированием. Наконец, выход полисом из некоторых тканей далеко не количественный, причем наиболее значительные (и, возможно, избирательные) потери характерны для начальных стадий низкоскоростного центрифугирования гомогената.

2.4.2. Осаждение полисом магнием

Вместо высокоскоростного центрифугирования полисом можно вызвать агрегацию (обратимую) этих структур добавлением солей магния до конечной концентрации 0,1 М. Это позволяет осадить полисомы из неочищенного гомогената низкоскоростным центрифугированием [12]. Соответствующая методика приведена в табл. 8. Преимущество этого подхода состоит в том, что он позволяет сравнительно быстро получить интактные полисомы при условии обычных мер предосторожности, предпринимаемых с целью подавления рибонуклеазной активности. При добавлении ионов магния осаждаются также неполисомные комплексы мРНП, но не осаждается свободная РНК.

2.4.3. Фракционирование полисом

Часто бывает желательно или необходимо разделить полисомы различных классов до выделения тех мРНК, которые в них содержатся. Это может оказаться необходимым, чтобы

Выделение эукариотической матричной РНК

265

Таблица 9. Разделение связанных и свободных полисом клеток мышиной миеломы [16, 17]

1. Суспендируйте промытые клетки в концентрации 5· 10s клеток/мл в холодном гипотоническом буфере (10 мМ КС1, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-НС1, рН 7,4). Дайте клеткам набухнуть в течение 5 мин.

2. Прогомогенизируйте клетки десятью движениями поршня в стеклянном гомогенизаторе Даунса с минимальным зазором.

3. Разведите гомогенат клеток в 5 раз буфером, имеющим следующий состав:

2,5 ? сахароза

0,15 ? КС1

5 мМ MgCl2

50 мМ трис-HCl, рН 7,4

4. Наслоите этот препарат на 2 объема 2,5 ? раствора сахарозы в том же буфере в центрифужной пробирке. Затем наслоите сверху 3 объема 2,05 ? сахарозы и 1 объем 1,2 ? сахарозы в том же буфере.

5. Отцентрифугируйте 5 ч при 82 000g при 4 °С в роторе Beckman SW28.1 или в эквивалентном ему роторе.

6. Соберите фракции, начиная со дна, для чего проколите пробирку иглой от шприца. Ядра осаждаются в слой 2,5 ? сахарозы. Свободные полисомы остаются в той области, куда был внесен образец, а связанные полисомы всплывают до границы 1,20 ? и 2,05 ? сахарозы.

7. Обработайте связанные полисомы 0,5%-ным (вес/объем) дезокскхолатом натрия и 0,5%-ным (вес/объем) детергентом Brij 58, чтобы растворить мембраны.

8. Отцентрифугируйте обработанные детергентом связанные полисомы и свободные полисомы по отдельности в градиенте сахарозы 15—30% в буфере, содержащем 80 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, на подушку (4 мл) из 69%-ной сахарозы в том же буфере. Центрифугирование проводите в роторе Beckman SW 28 или эквивалентном ему при скорости 27 000 об/мин (96 000g) в течение 8,5 ч.

9. Соберите полисомы, находящиеся на границе 30%-ной и 69%-ной сахарозы и разведите их одним объемом дистиллированной воды. Теперь их можно использовать или хранить при —70 °С.

определить, какие белки синтезируются отдельными популяциями полисом (например, связанными с мембранами и свободными полисомами); такое разделение может использоваться также в качестве первоначального этапа очистки индивидуальных мРНК, основанного на особенностях тех полисом, в которых они содержатся. В частности, широко используется процедура фракционирования по размеру в градиентах сахарозы. Она особенно полезна для выделения индивидуальных мРНК, наиболее широко представленных в общей популяции, если они существенно больше или меньше по размеру, чем мРНК. в среднем. Если имеются специфические антитела к тому или иному белку, кодируемому определенной мРНК, то используется еще один чрезвычайно эффективный подход, основанный на антигенной специфичности новообразованных полипептидных цепей в составе полисом, содержащих соответствующую мРНК- Эти подходы' описаны ниже.

1. Разделение свободных и связанных полисом. Был опубли-

266

Глава 8

кован ряд хороших методик практически количественного фракционирования связанных с мембранами и свободных полисом и последующего выделения из них мРНК. Наиболее подробно изучались в этом отношении ткани и клетки, активно секрети-рующие белки, в частности печень крысы [13—15] и культуры клеток мышиной миеломы [16—18]. Одна из возможных трудностей, возникающих при этом, — загрязнение связанных полисом лизосомами, богатыми рибонуклеазной активностью. В связи с этим были разработаны методы отделения фракции шероховатых микросомных мембран от лизосом без разрушения последних [13—18]. В табл. 9 приведена одна из таких методик, разработанная для миеломных клеток.

2. Фракционирование полисом по размеру. При условии соблюдения необходимых мер предосторожности, чтобы избежать разрушения полисом под действием рибонуклеаз (раздел 2.7) или в результате отделения рибосом во время лизиса клеток (гл. 9, разд. 7.1.2), можно фракционировать по размеру различные классы мРНК центрифугированием соответствующих полисом в непрерывных градиентах сахарозы. Вообще говоря, чем длиннее мРНК, тем крупнее полисомы, и наоборот, хотя возможны и отклонения от этого правила. Если некоторые индивидуальные мРНК индуцируют синтез белка более или менее эффективно, чем мРНК в среднем, то это приводит к повышению или понижению плотности упаковки рибосом на мРНК. Поскольку большинство мРНК близки по размеру, этот метод фракционирования мРНК применим только для частичной очистки особенно коротких мРНК, вроде тех, которые кодируют гистоны [19] или рибосомные белки [20], или особенно длинных мРНК, кодирующих, например, тяжелую цепь миозина [11].

Для фракционирования полисом по размеру обычно проводят центрифугирование при 4 °С в линейных градиентах концентрации сахарозы 10—40%, 15—45% или 20—50% в буфере, содержащем, например, 0,1 ? КС1, 3 мМ ацетат магния и 20 мМ трис-HCl, рН 7,6 (табл. 7). В некоторых случаях, в частности при фракционировании полисом из мышц [11], необходима более высокая концентрация соли, чтобы предотвратить агрегацию белка и осаждение. Режим центрифугирования и концентрация сахарозы в градиенте зависят от размера выделяемых полисом, и их следует подобрать эмпирически.

3. Иммунопреципитация полисом. Здесь можно использовать самые различные подходы, основанные на прямой или непрямой иммунопреципитации [4]. В первом случае специфические антитела связываются с полисомами, к ним добавляют антиген-носитель и антитела в достаточном количестве, чтобы образовать иммунопреципитат, который можно затем отцентрифугировать через слой сахарозы. Если используется непрямая иммунопре-

Выделение эукариотической матричной РНК

267

Таблица 10. Непрямая иммунопреципитация полисом с помощью вторичных антител [23, 25]

1. Силиконируйте всю стеклянную посуду, которая будет использована в опыте.

2. Суспендируйте полисомы в концентрации 10—25 единиц Л26о/мл в холодном буфере для связывания с антителами:

0,15 ? NaCl

5 мМ MgCl2

2 мг/мл гепарина

25 мМ трис-HCl, рН 7,1

3. Отцентрифугируйте 3 раза по 10 мин при 19 000g, сохраняя каждый раз супернатант. В результате этой процедуры удаляются нерастворимые агрегаты полисом.

4. Добавьте очищенные антитела (свободные от рибонуклеаз1) до концентрации ~ 150 мкг/мл; оптимальную концентрацию антител следует подобрать экспериментально. Проинкубируйте смесь 40 мин. при 2 °С.

5. Добавьте очищенные вторичные антитела1 (против первых антител) в 50— 70-кратном избытке и продолжайте инкубацию 2 ч при 2 °С.

6. Наслоите инкубационную смесь на 3 мл 0,5 ? сахарозы, наслоенной в свою очередь на 6 мл 1,0 ? сахарозы. Оба раствора сахарозы готовят на буфере для связывания антител с добавлением 0,4% тритона Х-100. Отцентрифугируйте 20 мин при 16 000g\

7. Отсосите супернатант и растворы сахарозы и отбросьте их. Осторожно промойте стенки пробирок 3 раза буфером для связывания антител, стараясь не взмутить осадок. Эта промывка позволяет снизить неспецифическое загрязнение иммунопрецнпитатов.

8. Суспендируйте каждый осадок в 1 мл буфера для связывания антител и снова осадите их через сахарозу, как описано в п. 6.

1 Очистка антител описана в работах [20, 23].

ципитация, то при добавлении вторичных антииммуноглобули-новых антител к комплексу полисом с первичными антителами образуется нерастворимый комплекс [21—23]. Стандартная методика приведена в табл. 10. Вместо преципитации ком

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2019)