J. R. J. Cell Biol., 72, 726 (1977).

7. Favaloro J., Treisman R., Kamen R. In: Methods in Enzymology, vol. 65, Grossman L. and Moldave K. (eds.), Academic Press, New York and London, p. 718. 1980.

«. Chirgwin J. M., Przybyla A. E., MacDonald R. !., Rutter W. J. Biochemistry

(Wash.), 18, 5294 (1979). 9. Raymond Y., Shore G. C. J. Biol. Chem., 254, 9335 (1979).

10. Auffray C, Rougeon F. Eur. J. Biochem., 107, 303 (1979).

11. Buckingham ?. E., Cohen ?., Gros F. J. Mol. Biol., 103, 611 (1976).

12. Palmiter R. D. Biochemistry (Wash.), 13, 3606 (1974).

13. Ramsey J. C, Steele W. J. Biochemistry (Wash.), 15, 1704 (1976).

14. Dissous C, Lempereur C, Verwaerde C, Krembel J. Eur. J Biochem , 83 17 (1978).

15. Adesnik M., Maschio F. Eur. J. Biochem., 114, 271 (1981)

16. Mechler В., Rabbitts Т. H. J. Cell Biol., 88, 29 (1981)

17. Mechler B. J. Cell. Biol., 88, 37 (1981).

18. Mechler B. J. Cell. Biol., 88, 42 (1981).

19. Schochetman G., Perry R. P. J. Mol. Biol., 63, 591 (1972).

¦20. Nabeshima Y.-L, lmai K., Ogata K. Biochim. Biophys. Acta, 564, 105 (1979)

21. Schechter I. Biochemistry (Wash.), 13, 1875 (1974).

22. Shapiro D. L, Taylor J. M., McKnight G. S., Palacios R., Gonzalez С Kiely M. L., Schimke R. T. J. Biol. Chem., 249, 3665 (1974).

23. Shapiro D. J., Schimke R. T. J. Biol. Chem., 250, 1759 (1975).

18*

276

Глава 8

24. Payvar F., Schimke R. T. Eur. J. Biochem., 101, 271 (1979).

25. Palacios R., Sullivan D., Summers ?. ?., Kiely ?. L., Schimke R. Т. J. BioL Chem., 248, 540 (1973).

26. Villa-Komaroff L., McDowell ?., Baltimore D., Lodish H. F. In: Methods :n Enzymology, vol. 30, Moldave K. and Grossman L. (eds.), Academic Press, Inc., New York and London, p. 709, 1974.

27. Rickwood D., Hames B. D., eds. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids, published by IRL Press Ltd., Oxford and Washington, DC, 1982.

28. Krystosek ?., Cawthon M. L., Rabat D. J. Biol. Chem., 250, 6077 (1975).

29. Lindberg U., Persson T. Eur. J. Biochem., 31, 246 (1972).

30. Firtel R. ?., Lodish H. F. J. Mol. Biol., 79, 295 (1973).

31. Rhoads R. E. J. Biol. Chem., 250, 8088 (1975).

32. Jain S. K., Pluskal M. G., Sarkar S. FEBS Lett., 97, 84 (1979).

33. Brawerman G., Mendecki J., Lee S. Y. Biochemistry (Wash.), 11, 637 (1972).

34. Schutz G., Beato M., Feigetson P. Biochem. Biophys. Res. Commun., 49, 680* (1972).

35. Gorski J., Morrison M. R., Merkel C. G., Lingrel J. B. J. Mol. Biol., 86, 363 (1974).

36. Greenberg J. R. Biochemistry (Wash.), 15, 3516 (1976).

37. Ricciardi R. P., Miller J. S., Roberts В. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76. 4927 (1979).

38. Bedard L. J. Virol., 46, 656 (1983).

39. Fellig J., Wiley С. E. Arch. Biochem. Biophys., 85, 313 (1959).

40. Scheele G., Blackburn P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4898 (1979).

41. Morton В., Nwizu C, Henshaw E. C., Hirsch C. ?., Hiatt ?. H. Biochim. Biophys. Acta, 395, 28 (1975).

ГЛАВА 9

ТРАНСЛЯЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ РНК В БЕСКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ

М. Клеменс

1. Введение

В последние годы для трансляции эукариотических матричных РНК использовалось несколько бесклеточных белоксинте-зирующих систем. Наибольшее распространение получили ли-заты ретикулоцитов кролика и экстракты зародышей пшеницы. Они имеют ряд преимуществ перед другими системами, и их легко получить, если только организовать лабораторную работу таким образом, чтобы предотвратить загрязнение рибонук-леазами и другими агентами. Кроме этих систем использовались также экстракты многих других клеточных культур и перевиваемых клеток асцитных опухолей, способные инициировать трансляцию и давать полноразмерные продукты трансляции. В этой главе рассмотрены приготовление и свойства таких эукариотических систем трансляции мРНК. Кроме того, в ней описана процедура обработки препаратов микрококковой нуклеазой для подавления белкового синтеза, направляемого эндогенными мРНК, рассмотрены разнообразные способы анализа продуктов трансляции экзогенной мРНК и обсуждено использование бесклеточных систем для исследования превращений первичных продуктов трансляции и механизмов регуляции синтеза белка. Прокариотические системы трансляции мы не рассматривали, так как в настоящее время для изучения множества аспектов экспрессии бактериальных и фаговых генов обычно применяют сопряженные системы транскрипции — трансляции (гл. 7).

2. Лизат ретикулоцитов

Хотя лизат ретикулоцитов можно приобрести у ряда фирм (табл. 1) и эти препараты очень удобны и уже оптимизированы в отношении трансляции мРНК (разд. 2.2), это весьма дорогой путь получения лизата. Во время написания статьи его цена составляла не менее 24 ф. ст. за 1 мл, а общая стоимость лизата, который можно получить из одного кролика, достигала примерно 500 ф. ст. Поэтому из соображений экономии безусловно целесообразно получать лизат самим.

278

Глава 9

Таблица 1. Фирмы, поставляющие реактивы для исследования трансляции в бесклеточных системах

Готовые системы трансляции

Лизат ретикулоцитов Лизат ретикулоцитов, обработанный нуклеазой

Бесклеточная система из зародышей пшеницы

Система из зародышей пшеницы, обработанная нуклеазой

Реактивы

Препарат аминоацил-тРНК — синтетаз Е. coli Эдеин

Глобиновая мРНК Препарат тРНК из клеток млекопитающих Микрококковая нуклеаза

Препарат микросомных мембран РНК втм

Collaborative Research

Amersham

BRL

Collaborative Research NEN

? and S Biochemicals BRL

BRL

Sigma

Calbiochem. BRL

Boehringer

Boehringer

P-L Biochemicals

NEN

Amersham

2.1. Приготовление и хранение лизата

Лизат ретикулоцитов получают путем лизиса эритроцитов кроликов, выздоравливающих после экспериментальной анемии. Рекомендуемая методика описана в табл. 2. Для подготовки животных было предложено много схем. Одна из них, с помощью которой мы получаем надежные результаты, состоит в следующем. У кроликов-самцов массой 2—2,5 кг вызывают анемию путем ежедневного введения (подкожно) в течение 4 дней 25 мг ацетилфенилгидразина (свежеприготовленный водный раствор, 10 мг/мл). Кровь берут спустя 5 дней (период реконваленсценции) (табл. 2). При использовании этой схемы гематокрит возрастает, в результате от каждого кролика можно получить больше эритроцитов и, следовательно, больше лизата. При этом проходит достаточно времени, чтобы ацетилфе-нилгидразин и продукты его метаболизма исчезли из крови. Для экономии времени имеет смысл работать сразу с несколькими кроликами. Нужно следить, чтобы на протяжении всего эксперимента кролики были здоровыми (не считая анемии).

На 9-е сутки после первой инъекции кроликов наркотизируют путем введения нембутала с гепарином в ушную вену (табл. 2). Если немного выбрить шерсть, вена хорошо видна на краю уха. Чтобы сделать инъекцию, нужен некоторый опыт;

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

279

Таблица 2. Получение лизата ретикулоцитов

1. Отберите несколько кроликов и вводите каждому подкожно по 2,5 мл ацетилфенилгидразина (10 мг/мл в воде) ежедневно в течение 4 дней.

2. Через 5 сут отберите у одного кролика кровь, как описано ниже.

3. Инъецируйте в ушную вену 1,0—1,5 мл нембутала и 1 мл 1%-го гепарина в 0,9%-ном NaCl. Убедитесь в полной наркотизации животного.

4. Отберите кровь путем пункции сердца и храните ее во льду.

5. Отцентрифугируйте кровь в бакет-роторе 10 мин при и 4 °С.

6. Отсосите супернатант и ресуспендируйте клетки с помощью стеклянной палочки в 200 мл следующего буфера:

0,14 ? NaCl 5 мМ КС1

5 мМ ацетат магния 5 мМ глюкоза

5 мМ HEPES (рН следует довести раствором КОН до 7,2)

7. Отцентрифугируйте клетки, как указано в п. 5.

8. Повторите этапы 6 и 7 еще дважды. Последний раз отцентрифугируйте клетки 15 мин при 1600g\

9. Отсосите супернатант, измерьте объем плотного клеточного осадка и ли-зируйте клетки добавлением 1,0—1,5 объемов холодного бидистиллята. Тщательно перемешайте.

10. Отцентрифугируйте 20 мнн при 21 000^ и 4 "С в пробирках из стекла Согех или в прозрачных пластиковых пробирках1.

11. Отберите супернатант, стараясь не загрязнить его частицами осадка (стромы). Разделите лизат на аликвоты по 1 мл, быстро заморозьте и храните в жидком азоте.

1 Прозрачные пробирки нужны для того, чтобы легче было отобрать чистый супернатант на этапе 11.

ее лучше проводить с ассистентом, который будет крепко держать кролика. Наркоз наступает быстро, при этом сердце должно сокращаться нормально. Наркотизированное животное кладут на спину и берут кровь путем пункции сердца, используя толстую иглу, присоединенную к гибкому пластиковому шлангу. Сердце должно достаточно быстро выталкивать кровь. Если этого не происходит или сердце останавливается, кровь все-таки можно собрать. Для этого нужно вскрыть грудную клетку, надрезать аорту и отсосать кровь шприцем. Она не свернется, поскольку при инъекции был введен гепарин. Собранную кровь следует держать во льду. Относительная активность лизатов ретикулоцитов, полученных от различных кроликов, часто сильно колеблется. Поэтому рекомендуется хранить кровь, взятую у разных животных, по отдельности на тот случай, если наименее активные препараты содержат ингибиторы, которые будут подавлять активность лучших лизатов. Выход крови должен быть до 100 мл от одного животного. Чтобы подсчитать число ретикулоцитов, смешивают несколько капель крови с 1%-ным бриллиантовым крезиловым голубым в физиологическом растворе и изучают мазок под микроскопом с иммерсионным объективом. Правда, опыт показывает, что число ретикулоцитов

280

Глава 9

не всегда коррелирует с трансляционной активностью полученного лизата.

Клетки собирают центрифугированием, промывают и лизи-руют холодной водой (табл. 2). После центрифугирования для удаления стромы лизат можно либо сразу заморозить аликво-тами по 1 мл в жидком азоте и в таком виде хранить, либо вначале обработать микрококковой нуклеазой (разд. 2.4). При хранении в жидком азоте лизаты ретикулоцитов сохраняют свою активность очень долго (не менее 2 лет). При —70 °С их можно хранить несколько месяцев, но хранение при —20 °С не рекомендуется. Пре