Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

жде чем транспортировать лизаты в сухом льду, их следует заплавить в пластиковые пакеты, чтобы они не потеряли активность под действием высокой концентрации двуокиси углерода. После того как лизат разморожен, его лучше снова не замораживать, хотя один раз это можно сделать без большой потери активности.

2.2. Оптимизация активности

Каждый из приготовленных лизатов следует охарактеризовать по белоксинтезирующей активности в зависимости от концентрации гемина — соединения, предотвращающего активацию репрессора трансляции в этой системе [1]. Такой эксперимент не только показывает, каков уровень включения аминокислот при трансляции эндогенной мРНК в стандартных условиях, но и дает информацию о том, в какой степени экстракт стимулируется гемином и какова оптимальная концентрация гемина, дающая этот эффект. Вообще говоря, у наиболее активных лизатов наблюдается наибольшая реакция на добавление гемина.

Исходный раствор гемина трудно приготовить и хранить, если не следовать правильной методике. Растворы остаются стабильными только в 90%-ном этиленгликоле, забуференном трис-HCl (рН 7,8). В табл. 3 приведена методика приготовления раствора. Чтобы определить оптимальную концентрацию гемина, лизат инкубируют с различными количествами этого раствора вплоть до конечной концентрации 40 мкМ в условиях, когда может идти синтез белка (разд. 2.3). В качестве меченой

Таблица 3. Приготовление исходного раствора гемина

1. Растворите 6,5 мг гемина в 0,25 мл 1 ? КОН.

2. Добавьте следующие растворы в указанном порядке, перемешивая смесь после каждого добавления:

0,5 мл 0,2 ? трис-HCl, рН 7,8 8,9 мл этиленгликоля 0,25 мл 1 ? НС1

3. Храните раствор при —20°С. Конечная концентрация гемина 1 мМ.

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

281

Рис. 1. Определение оптимальной концентрации гемина для синтеза белка в лизате ретикулоцитов. Свежеприготовленный лизат инкубировали в присутствии указанных концентраций гемина 60 мин при 30 °С в условиях, указанных в табл. 4. Для определения включившейся в белки метки отбирали аликвоты объемом 20 мкл и определяли их радиоактивность, как описано в табл. 6.

Гемин, мкМ

аминокислоты берут [14С]-лейцин. После инкубации в течение 60 мин при 30 °С определяют степень включения радиоактивного лейцина. В большинстве случаев в хороших лизатах наблюдалось примерно 10-кратное увеличение скорости трансляции в присутствии гемина при оптимальной его концентрации 10— 20 мкМ. На рис. 1 приведен результат типичного опыта. Вычисленная скорость включения добавленного лейцина в оптимальных условиях составляет в хороших, не обработанных нуклеазой лизатах около 50 пмоль/мин в реакционной смеси объемом 20 мкл, хотя истинная скорость выше, так как сам лизат содержит значительное количество лейцина.

2.3. Условия инкубации для синтеза белка

Лизат ретикулоцитов содержит в значительном количестве эндогенные мРНК (в основном кодирующие а- и ?-глобины), которые могут транслироваться в благоприятных условиях инкубации. В таком режиме лизат ретикулоцитов используется в настоящее время главным образом только для изучения механизма синтеза белка (разд. 7.1). Для трансляции экзогенных мРНК, выделенных из других источников (гл. 8), лизат обычно

282

Глава 9

Таблица 4. Условия инкубации для лизата ретикулоцитов

Исходные растворы

Смесь солей, аминокислот и соединений — источников энергии (5-кратная)1:

0,375 ? KG2

10 мМ ацетат магния

15 мМ глюкоза

0,25—1,0 мМ аминокислоты

20 мкКи/мл [14С]-лейцина (20—30 мКи/ммоль) или до 2,5 мКи/мл [35S]-MeTHOHHHa (— 1200 Ки/ммоль) 5 мМ АТР 1 мМ GTP

50 мМ трис-HCl, рН 7,6

Креатинфосфат — креатинфосфокиназа (10-кратный исходный раствор)3: 70 мМ креатинфосфат 10 мг/мл креатинфосфокиназы Реакционная смесь

Для составления каждой инкубационной смеси (конечный объем

100 мкл) аккуратно смешайте во льду в стерильной микроцентрифужной

пробирке следующие компоненты: 50 мкл лизата ретикулоцитов (оттаивайте лизат непосредственно перед использованием в присутствии гемина в концентрации, в два раза превышающей оптимальную);

20 мкл смеси солей, аминокислот и соединений — источников энергии (5-кратный раствор);

10 мкл креатинфосфата— креатинфосфокиназы (10-кратный исходный раствор);

20 мкл воды или других компонентов (например, экзогенной мРНК, если требуется, до конечной концентрации 5—100 мкг/мл). Инкубируйте при 30 °С.

1 Может храниться длительное время при — 20 °С (если используется [14С] -лейцин) или при —70 °С (если используется [35Э1-метионин).

2 Если вместо хлористого калия использовать ацетат калия, можно создать в системе трансляции более высокую концентрацию иоиов К+, необходимую для трансляции некоторых экзогенных мРНК; повышенная концентрация хлорид-нона ингибирует инициацию.

3 Смесь готовят непосредственно перед использованием.

перед использованием обрабатывают микрококковой нуклеазой (разд. 2.4), чтобы понизить трансляцию эндогенных глобиновых мРНК. Описанные ниже условия инкубации оптимальны как для трансляции эндогенной мРНК, так и для трансляции (после небольших модификаций; см. разд. 2.4.2) экзогенных мРНК в лизате, обработанном нуклеазой.

Когда лизат ретикулоцитов используется в качестве бесклеточной тест-системы синтеза белка, важно, чтобы концентрация самого лизата была как можно выше; при этом обеспечивается максимальная интенсивность трансляции. После определения оптимальной концентрации гемина (разд. 2.2) желательно оттаивать замороженный лизат сразу в присутствии двукратной концентрации гемина; при проведении реакции лизат должен составлять 50% конечного объема реакционной смеси. В табл. 4

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

283

Таблица 5. Конечные концентрации компонентов в инкубационной смеси с лизатом ретикулоцитов

75 мМ КС11

2мМ ацетат магния

3 мМ глюкоза

50—200 мкМ аминокислоты

4 мкКи/мл [14С]-лейцина (или до 500 мкКи/мл [355]-метионина) 1 мМ АТР

0,2 мМ GTP

10 мМ трис-HCl, рН 7,6

7 мМ креатинфосфат

1 мг/мл креатинфосфокиназы

10—20 мкМ гемин

До 100 мкг/мл мРНК2

1 См. вторую сноску к табл. 4.

2 Если исследуется трансляция экзогенной мРНК.

приведен состав растворов для реакции и указан удобный порядок внесения отдельных компонентов. Конечные концентрации всех компонентов даны в табл. 5; кроме того, с лизатом вносится некоторое количество ионов К+ (до 20 мМ) и Mg2+ (1 мМ). Некоторые исследователи не включают в смесь солей, аминокислот и источников энергии (табл. 4) АТР и GTP, поскольку они также присутствуют в лизате. В этом случае уменьшают и конечную концентрацию ацетата магния (до 0,5 мМ).

Если необходимо транслировать экзогенные мРНК, их добавляют в лизат ретикулоцитов (обычно после обработки нуклеазой: см. разд. 2.4) вместо такого же объема воды (табл. 4) до конечной концентрации 5—100 мкг/мл. В этом случае оптимальные концентрации солей могут отличаться от указанных в табл. 5, и их следует определить в предварительных экспериментах.

Инкубацию удобно проводить в микроцентрифужных пробирках одноразового пользования, применяя для добавления компонентов и отбора проб автоматические микропипетки (типа Finn pipettes) или микрокапилляры (типа Drummond). Важно тщательно перемешивать содержимое пробирок (не вспенивая его), так как лизат имеет очень высокую плотность. До начала инкубации все компоненты следует держать во льду. Для длительного синтеза белка инкубацию лучше всего проводить при 30°С. В оптимальных условиях включение аминокислот нарастает линейно в течение по крайней мере 60 мин. Если включение перестает нарастать раньше этого времени, стоит проверить, какая часть меченой аминокислоты включилась, так как в случае очень активных лизатов может быстро исчерпаться запас аминокислот в среде, если их не добавить в достаточном количестве. Таким образом, в этой системе использование пред-

284

Глава 9

Таблица 6. Определение включения аминокислот в системе лизата ретикулоцитов1

Метод нанесения на бумажные фильтры

1. Нанесите аликвоты (2—10 мкл) каждой инкубационной смеси на отдельные пронумерованные круглые фильтры Whatman № 1 диаметром 2,5 см, разложенные на листе алюминиевой фольги.

2. Поместите фильтры в стакан с 5%-ной ТХУ, охлажденной во льду, и промойте их, осторожно помешивая в течение 15 мин.

.3. Перенесите фильтры в 5%-ную ТХУ, нагретую до 90"С, и проинкубируйте 15 мин при этой температуре, чтобы гидролизовать аминоацилированные тРНК.

4. Перенесите фильтры в стакан со свежей порцией 5%-ной ТХУ при комнатной температуре и промойте их, осторожно помешивая в течение 15 мин.

5. Промойте фильтры абсолютным этанолом, а затем ацетоном, осторожно помешивая в каждом растворителе в течение 1 мин.

6. Просушите фильтры при комнатной температуре на алюминиевой фольге.

7. Налейте на каждый фильтр 40 мкл 10%-ной (вес/объем) перекиси водорода и оставьте при комнатной температуре примерно на 1 ч. При этом пробы обесцвечиваются, и тем самым предотвращается тушение флуоресценции при просчете радиоактивности в сцинтилляторе.

8. За время инкубации перекись водорода высохнет. Поместите каждый фильтр во флакон или в специальный вкладыш и просчитайте радиоактивность проб в каком-либо толуольном сцинтилляторе.

Метод фильтрования

1. Перенесите аликвоту (2—10 мкл) каждой реакционной смеси в 0,5 мл воды и добавьте 0,5 мл 1,0 ? NaOH, чтобы гидролизовать аминоацил-тРНК, и 50 мкл 30%-ной (вес/объем) перекиси водорода (чтобы обесцветить образцы).

2. Как только образцы обесцветятся, добавьте 0,25 мл 50%-ной ТХУ до конечной концентрации 10%. Перемешайте и перенесите образцы в лед на 30 мин, чтобы осадить белки.

3. Профильтруйте каждую пробу через стекловолокнистый фильтр GF/C диаметром 2,5 см с помощью приспособления для одновременного нанесения нескольких образцов, присоединенного к вакууму.

4. Промойте каждый фильтр, лежащий на подложке приспособления для фильтрования, тремя порциями 5%-ной ТХУ по 10 мл.

5. Промойте каждый фильтр 10 мл абсолютного этанола.

6. Просушите фильтры под инфракрасной лампой и определите радиоактивность в толуол

страница 64
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2019)