Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

легкость приготовления системы и стабильность при хранении. Матричные РНК участвуют во многих циклах белкового синтеза: за 90 мин инкубации каждая активная молекула мРНК успевает транслироваться 40—70 раз, а скорость элон-

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

289·

гации полипептидной цепи составляет почти 1 аминокислота/с при 26°С [5].

В противовес этим ценным свойствам следует отметить, что активность лизатов ретикулоцитов практически невозможно предсказать заранее и хорошие лизаты получаются с переменным успехом. Кроме того, они чрезвычайно чувствительны к некоторым ингибиторам, прежде всего к низким концентрациям двухцепочечной РНК и окисленных тиолов, которые иногда присутствуют в компонентах реакционной смеси. Например, некоторые препараты РНК, хорошо транслируемые в системе из зародышей пшеницы (разд. 3), плохо функционируют в системе лизата ретикулоцитов или даже проявляют ингибирующее действие (S. Trevor-Roper, неопубликованные данные, полученные в лаборатории автора). Кроме того, лизат ретикулоцитов может обладать специфическими регуляторными свойствами, например проявлять строгую потребность в гемине, что делает его нетипичной моделью для исследования регуляторных механизмов трансляции.

В качестве бесклеточной системы для трансляции экзогенных эукариотических клеточных и вирусных РНК наиболее широко используется лизат ретикулоцитов, обработанный микрококковой нуклеазой, и такие препараты можно купить у ряда фирм (см. табл. 1). Их используют не только для изучения определенных продуктов трансляции, но и при исследовании конкуренции различных мРНК, их инактивации и при анализе регуляторных аспектов самого процесса синтеза белка. Зависимые от матрицы лизаты ретикулоцитов использовались в сопряженных системах транскрипции — трансляции с вирусными кор-частицами, содержащими эндогенные РНК-полимеразы. Это часто позволяет обнаружить ранние вирусные продукты, которые не так легко выявить в зараженных клетках [6]. Кроме того, в подобных системах возможны посттранскрипционные модификации, в результате которых образуются активные РНК-матрицы, необходимые для исследований. Такой трансляционный анализ можно использовать для выявления кодирующих последовательностей среди продуктов системы транскрипции Мэнли — экстракта целых клеток (гл. 3). В этой системе в качестве матриц применяются клонированные молекулы ДНК — целые или расщепленные ферментом рестрикции.

При всех этих достоинствах важно иметь в виду одну возможную проблему, возникающую при работе с лизатами, обработанными нуклеазой. Было показано, что после ферментативного расщепления в системе остается значительное количество фрагментов мРНК, в том числе последовательности, включающие участки инициации [8]. Следовательно, образование 80S-комплекса инициации не полностью зависимо от экзогенной

19-953

290

Глава 9

мРНК, даже если трансляция на инициирующих фрагментах идет слабо. Добавленные мРНК вынуждены конкурировать с этими фрагментами за связывание с рибосомами, и молекулы РНК со слабыми участками инициации могут делать это недостаточно эффективно. Наконец, следует подчеркнуть, что обработка нуклеазой не может совершить чудо. Бесклеточная система трансляции не может быть лучше исходного экстракта, ¦и экстракт с плохо идущей инициацией останется такой же плохой системой после обработки микрококковой нуклеазой.

3. Экстракты зародышей пшеницы

Экстракты зародышей пшеницы — как обработанные микро-'кокковой нуклеазой, так и без такой обработки — имеются в продаже (табл. 1). Как и лизаты ретикулоцитов, они весьма дороги (90 ф. ст. за 1 мл), несмотря на то, что систему из зародышей пшеницы очень легко приготовить (см. работу [9] и разд. 3.1).

3.1. Приготовление и хранение экстрактов

Одно из основных достоинств бесклеточной системы из зародышей пшеницы состоит в доступности исходного материала; подходящие зародыши пшеницы (т. е. не подвергнутые терми-Таблица 8. Приготовление экстракта зародышей пшеницы

vBce процедуры следует проводить при 4 "С.

Растирайте зародыши пшеницы в течение 3 мин с равным по массе количеством промытого, автоклавированного песка в холодной ступке в присутствии 4,5 мл буфера для экстракции на 1 г массы зародышей. Буфер для .экстракции имеет следующий состав:

0,1 ? КС1 . .1 мМ ацетат магния

2 мМ СаС12

6 мМ 2-меркаптоэтанол

40 мкМ спермидин

20 мМ HEPES (довести рН до 7,6 раствором КОН)

2. Отцентрифугируйте образовавшуюся пасту 10 мин при 30 OOOg.

3. Отберите среднюю часть супернатанта, стараясь не захватить плавающую пленку липидов.

>4. Отдиализуйте полученную фракцию супернатанта в проавтоклавированных диализных трубках или пропустите ее через колонку с сефадексом G-25 (грубым) (не менее 5 мл смолы на 1 мл экстракта). В обоих случаях следует уравновесить экстракт следующим раствором: " 0,12 ? КС1

5 мМ ацетат магния

6 мМ 2-меркаптоэтанол 40 мкМ спермидин

20 мМ HEPES (довести рН до 7,6 раствором КОН) 5. Разделите полученный экстракт на аликвоты и храните его при — 70 °С или в жидком азоте.

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

291

ческой обработке и без добавления каких-либо консервантов) можно купить в большинстве «магазинов здоровой пищи». Правда, иногда возникает необходимость в приготовлении экстракта зародышей из нескольких источников и в сравнении их активности (разд. 3.2), так как и уровень эндогенного включения аминокислот, и степень стимуляции при добавлении мРНК сильно колеблются от партии к партии [10]. Процедура приготовления экстракта подробно описана в табл. 8.

3.2. Условия инкубации для синтеза белка

Оптимальные условия синтеза белка в системе заоолышей

ГаГТз)13 °ПН0ВН0М ТЗКИе Же' КаК ДЛЯ ^зата^етикулодитов (разд. 2.3). Правда, в отличие от лизата ретикулоцитов эндо-

ь НД1ТРапЛЯЦИОННаЯ «тивность системы зародышей пшеницы низка. Поэтому трансляция в ней сильно зависит от добав-

25

20

15

S 10

* 5

5 -

0 - >^ Глобиновая

> - мРНК

- Клеточная

- /Л P0ly(A)+-PHK

¦--· -I _ ? Без РНК --] ?

20

40 60 Время, мин

80

Рис. 3. Трансляция ро1у(А)+-мРНК из ретикулоцитов кролика и эритролей-кемических клеток в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Инкубацию проводили при 25 °С в отсутствие РНК или после добавления poly(А+)-РНК из эритролейкемических клеток мышей (13 мкг/мл) или глобиновой мРНК (20 мкг/мл). Концентрация [355]-метионина—130 мкКи/мл. Через указанные промежутки времени отбирали аликвоты объемом 5 мкл для определения включившейся в белки радиоактивности, как описано

в табл. 6.

19·

292

Глава 9

_Таблица 9. Условия инкубации для экстрактов зародышей пшеницы_

Исходные растворы

Смесь солей, аминокислот и соединений — источников энергии (5-кратная)1:

0,17—0,37 ? КС12

5—10 мМ ацетат магния

0,5 мМ аминокислоты без метионина (или без другой аминокислоты, в зависимости от того, какая меченая аминокислота будет использоваться).

До 2,5 мКи/мл [35 5]-метионина (~ 1200 Ки/ммоль) или другой мече

ной аминокислоты

6,5 мМ АТР

.1,25 мМ GTP

.12,5 мМ ДТТ

0,19 мМ спермидин

70 мМ HEPES (довести рН до 7,6 раствором КОН) Креатинфосфат—¦ креатинфосфокиназа (10-кратный исходный раствор): 0,16 ? креатинфосфат 7 мг/мл креатинфосфокиназы Реакционная смесь

Для составления каждой инкубационной смеси (конечный объем 50 мкл) аккуратно смешайте в стерильной микроцентрифужной пробирке во льду следующие компоненты:

15 мкл экстракта зародышей пшеницы (оттаивайте его непосредственно перед использованием)

10 мкл 5-кратного исходного раствора солей, аминокислот и соединений — источников энергии

5 мкл 10-кратного исходного раствора креатинфосфата — креатинфосфокиназы

20 мкл раствора мРНК (до конечной концентрации 20—80 мкг/мл) Проинкубируйте при 25 °С.

1 Точные концентрации ионов К+ и Mg2+ зависят от особенностей транслируемой ????. н их следует определить экспериментально.

2 Если вместо хлористого калия использовать ацетат калия, можно создать в системе трансляции более высокую концентрацию ионов К+, необходимую для трансляции некоторых экзогенных мРНК; повышенные концентрации хлорид-иона ингнбируют инициацию.

Таблица 10. Конечные концентрации компонентов в инкубационной смеси с экстрактом зародышей пшеницы

70—110 мМ КС11

2,5—3,5 мМ ацетат магния

100 мкМ аминокислоты, кроме метионина (или другой аминокислоты, в зави

симости от того, какой меченый предшественник используется) До 500 мкКи/мл [355]-метионина (или другой меченой аминокислоты) 1,3 мМ АТР 0,25 мМ GTP 16 мМ креатинфосфат 0,7 мг/мл креатинфосфокиназы 2,5 мМ ДТТ 50 мкМ спермидин 20 мМ HEPES (рН 7,6) До 80 мкг/мл мРНК

1 См. последнюю сноску в табл. 9.

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

293

ленной мРНК, так что точные условия проведения эксперимента могут несколько колебаться в зависимости от мРНК. В табл. 9 описана процедура приготовления типичной реакционной смеси объемом 50 мкл, а в табл. 10 указаны конечные концентрации всех компонентов. Концентрация добавленной мРНК обычно составляет 20—80 мкг/мл. Для каждого препарата мРНК необходимо построить кривую зависимости включения от концентрации мРНК при температуре инкубации 25 °С. Включение аминокислот должно нарастать линейно в течение по крайней мере 1 ч. В присутствии ингибитора рибонуклеазы из плаценты человека (гл. 8, разд. 2.7) трансляция идет еще дольше, до 3 ч. Рис. 3 иллюстрирует использование системы зародышей пшеницы для трансляции глобиновой мРНК и РНК из мышиных клеток эритролейкемии Френд.

3.3. Обработка микрококковой нуклеазой

Уровень фонового включения в экстрактах зародышей пшеницы весьма низок; он слегка колеблется, и его можно еще более понизить путем обработки экстрактов микрококковой •нуклеазой. Методику обработки нуклеазой лизата ретикулоцитов (разд. 2.4.1) можно использовать без всяких изменений (следует лишь исключить гемин) и для приготовления экстракта зародышей пшеницы. Условия инкубации для обработанного нуклеазой экстракта зародышей пшеницы такие же, как и в случае необработанных экс

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2019)