тки клеточных экстрактов (был ли он предынкубирован, диализован, подвергнут гель-фильтрации и т. п.), оптимальные концентрации лучше всего подобрать для каждого нового препарата экстракта и каждой мРНК, которую предстоит исследовать. Добавление спермидина до конечной концентрации 0,4 мМ стимулирует трансляцию и снижает оптимальную концентрацию ионов магния, особенно в системах, которые были отдиализованы или пропущены через сефадекс; поэтому следует также подобрать оптимальную концентрацию этого компонента. Как и в бесклеточных системах ретикулоцитов (табл. 4) или зародышей пшеницы (табл. 9), замена хлорида калия на

298

Глава 9

ацетат калия позволяет использовать при синтезе белка более высокую концентрацию ионов К+, так как высокая концентрация хлорид-ионов подавляет инициацию. Это особенно ценно, когда используются мРНК, у которых максимальная скорость инициации достигается лишь при высокой концентрации ионов К+. (Правда, вряд ли концентрацию ионов ацетата, доходящую до 0,15 М, можно назвать физиологической.)

В эукариотических бесклеточных системах используют одну из двух систем генерирования энергии. Система, включающая пируваткиназу и фосфоенолпируват, имеет то преимущество, что она может непосредственно превращать ADP в АТР и GDP в GTP, тогда как системе, включающей креатинфосфокиназу и креатинфосфат, для регенерации GTP необходимы нуклеозид-дифосфаткиназа (которая уже имеется в клеточном экстракте) и АТР. Сообщалось, что некоторые препараты креатинфосфокиназы загрязнены рибонуклеазой, а креатинфосфат — пирофос-фатом (ингибитором аминоацилирования тРНК). Тем не менее в большинстве случаев это сочетание хорошо работает в качестве системы генерирования энергии. Для синтеза АТР при добавлении фруктозо-1,6-бисфосфата можно использовать и эндогенные ферменты гликолиза при условии, что in vitro этот путь достаточно эффективен и способен поддерживать нужный уровень АТР.

Следует сказать несколько слов о других компонентах. В качестве буфера лучше использовать HEPES, чем трис, так как у него ниже значение р/С и оно мало изменяется при изменении температуры в интервале от 0 до 37 °С. Для достижения максимальной активности экстрактов, которые были подвергнуты диализу или фракционированию на сефадексе, необходимо добавить ДТТ или 2-меркаптоэтанол; эти соединения, если они присутствуют во всех буферных растворах, защищают эндогенный ингибитор рибонуклеазы от инактивации. Сравнительно низкая рибонуклеазная активность во многих эукариотических бесклеточных системах, по-видимому, объясняется именно тем, что в них присутствует избыток этого эндогенного ингибитора. Концентрации аминокислот в экстрактах культивируемых клеток, как правило, достаточно поддерживать на уровне около 40 мкМ (кроме радиоактивной аминокислоты, концентрация которой ниже). Поскольку эффективность этих систем гораздо ниже, чем у лизата ретикулоцитов (разд. 2.3), можно не опасаться, что за время бесклеточного синтеза белка исчерпаются запасы какой-либо аминокислоты.

Включение аминокислот регистрируется точно так же, как в случае лизата ретикулоцитов (табл. 6; разд. 2.3), только не проводят обесцвечивания перекисью водорода. Обычно для определения радиоактивности отбирают пробы объемом 10—20 мкл.

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах 299

4.4. Обработка микрококковой нуклеазой

Обработанные нуклеазой бесклеточные экстракты можно приготовить по методике, описанной для лизата ретикулоцитов (разд. 2.4), за исключением того, что не нужно добавлять ге-мин. Как и в случае лизата ретикулоцитов, эндогенная мРНК при этом деградирует, в результате чего бесклеточный экстракт становится зависимым от экзогенной мРНК и фоновое включение аминокислот уменьшается. Некоторые авторы [15] после нуклеазной обработки и добавления ЭГТА фракционируют экстракты с помощью гель-фильтрации для удаления эндогенных аминокислот, однако это совершенно не обязательно. Условия инкубации при использовании обработанных нуклеазой экстрактов такие же, как и для необработанных (разд. 4.3).

4.5. Другие бесклеточные системы

В разд. 4.1—4.4 было описано приготовление и использование бесклеточных систем из клеток асцитной опухоли Эрлиха и других подобных клеток, например HeLa или мышиных L-кле-ток. Кроме того, активные экстракты были выделены из дрожжей Saccharomyces cerevisiae [16]. Оказалось также, что из очищенных или частично очищенных компонентов можно создавать фракционированные системы, в которых осуществляется синтез полноразмерных полипептидных продуктов [17, 18]. Для этого необходимо выделить рибосомные субчастицы, факторы инициации, элонгации и терминации, тРНК и аминоацил-тРНК—синтетазы, а также мРНК. Эта работа весьма трудоемка, но подобные исследования дали важную информацию о роли различных компонентов механизма белкового синтеза. Если читателя интересуют подробности тех методов, которые применяются в этой более узкой области исследований, ему следует обратиться к оригинальным работам [17, 18].

4.6. Достоинства и недостатки бесклеточных систем культивируемых клеток

Из клеток млекопитающих, растущих в культуре, или из клеток асцитных опухолей не составляет труда получить не-фракционированные постмитохондриальные экстракты. Если речь идет об асцитных клетках, необходимо позаботиться о пересеве клеток и о содержании животных — их хозяев. Культивируемые клетки необходимо нарастить в достаточно большом количестве. Это не составляет особого труда в случае быстро делящихся клеток в суспензионной культуре, например клеток асцитной опухоли Эрлиха или HeLa; достаточное количество

300

Глава 9

клеточных экстрактов можно получить из 1—5 л культуры. С клетками, растущими в монослое, возникает больше проблем, однако небольшое количество активного экстракта легко приготовить и в этом случае. В целом это несколько проще, чем! получить препарат лизата ретикулоцитов, и сложнее, чем приготовить систему из зародышей пшеницы.

Основной недостаток бесклеточных систем клеток млекопитающих неэритроидной природы — сравнительно низкая белок-синтезирующая активность. В экстрактах из некоторых типов клеток наблюдается лишь слабая инициация синтеза полипептидов на любых экзогенных мРНК, хотя большинство экстрактов способно осуществлять элонгацию предсуществовавших незавершенных полипептидных цепей. В тех системах, где инициация идет сравнительно активно (клетки асцитной опухоли Эрлиха, мышиные L-клетки и HeLa), скорость элонгации цепи часто оказывается низкой по сравнению со скоростью in vivo, а при трансляции длинных мРНК. возможна преждевременная терминация в некоторых участках. Тем не менее трансляция обычно идет правильно, и инициация происходит только в местах истинных стартовых кодонов. Даже в случае трансляции таких длинных матриц, как РНК вирусов полиомиелита или ЭМК, образуется некоторое количество полноразмерных продуктов (до 250 000 кДа), особенно при высокой концентраций-ионов К+ (концентрация 0,155 ? оптимальна для элонгации, хотя и несколько велика для максимальной инициации). Кроме того, в клеточных экстрактах часто происходит правильное расщепление больших вирусных полибелков с образованием аутентичных продуктов меньшего размера [19]. Бесклеточные системы из клеток млекопитающих использовались также для правильной трансляции продуктов вирусной транскрипции, образованных in situ сердцевинной частью вирионов, добавленной в реакционную смесь. В этом отношении подобные системы обладают тем уникальным свойством, что их можно использовать для изучения изменений трансляционной и посттрансляционной активности, возникающих при различных воздействиях на клетки, из которых они получены, например при вирусной инфекции или голодании (разд. 7.2).

Причины пониженной эффективности инициации и элонгации в системах из любых клеток млекопитающих, кроме ретикулоцитов, неясны. Возможно, отчасти это связано с тем, что значительная часть рибосом (видимо, вместе со связанными факторами и тРНК) теряется во время получения экстрактов. В некоторых случаях фактор инициации транскрипции eIF-2 инактивируется в результате фосфорилирования эндогенными протеинкиназами. Добавление гемина во время приготовления [20] или при инкубации [21] экстрактов может предотвратить

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных, экстрактах._30F

инактивацию фактора и таким образом стимулировать инициацию. Однако гемин не всегда эффективен, и часто, несмотря на образование комплекса инициации между рибосомной 40S-cy6-частицей и формилметиониновой тРНК (для этого необходим» активный фактор eIF-2), система все-таки оказывается не в состоянии осуществить полный цикл инициации синтеза полипептидов. Вполне возможно также, что «камнем преткновения» служит связывание мРНК с рибосомами. По-видимому, как эндогенная, так и экзогенная мРНК сохраняются в экстракте в нетранслируемой форме (в виде РНП-комплексов), а не деградируют в сколько-нибудь заметной степени. В самом деле, при предынкубации многих клеточных экстрактов мРНК сравнительно мало деградирует, так как трансляцию можно реактивировать с помощью гель-фильтрации системы [15]. По всей вероятности, во время инкубации бесклеточных систем из клеток млекопитающих происходит накопление небольших молекул, обладающих ингибирующим действием, например GDP, и в результате инициация сразу же блокируется. Так, быстрое исчезновение АТР и GTP даже при наличии системы генерирования энергии наблюдалось в бесклеточной системе из печени (S. Morley, University of Cambridge, личное сообщение). Очевидно, очень важно поддерживать необходимую концентрацию АТР и GTP и предупреждать накопление продуктов их расщепления.

5. Анализ продуктов трансляции

Успешное получение активного бесклеточного лизата и мРНК, которая в нем транслируется, — лишь первый этап всестороннего изучения мРНК. Почти во всех случаях необходимо иссле^ довать природу синтезируемых полипептидных продуктов — или для того, чтобы установить, что мРНК, продукт которой уже известен, транслируется правильно, или чтобы выяснить, какие белки кодирует данная мРНК. Определив количество специфических продуктов, можно