л буфера для иммунопреципитации без детергента и перенесите его в другую микроцентрифужную пробирку объемом 0,4 мл2. Отцентрифугируйте, как указано в п. 5.

8. Отберите и отбросьте супернатант. Ресуспендируйте осадок в 20 мкл буфера ос ДСН для нанесения на ПААГ (разд. 5.2) и прогрейте 3 мин при

9. Удалите сефарозу с пришитым белком А с помощью центрифугирования (если она использовалась на стадии б) и проанализируйте растворенный антиген с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН (разд. 5.2).

1 Лучше всего проводить всю эту процедуру сразу после трансляции, так как замораживание меченых продуктов трансляции до иммунопреципитации может привести к иеспецифическому осаждению денатурированных белков. Если все-таки образец придется, заморозить, то перед добавлением антисыворотки следует удалить весь нерастворимый материал с помощью центрифугирования.

2 Перенос в новые пробирки позволяет свести к минимуму загрязнение белком, сорбированным на стенках предыдущей пробирки.

сока. Особенно ценно, если триптические пептиды, помеченные in vitro одним изотопом, можно сравнить с пептидами того же белка, помеченного другим изотопом.

В табл. 14 описана методика расщепления трипсином меченых продуктов сразу после проведения трансляции. Если нужно проанализировать спектр триптических пептидов после их разделения с помощью электрофореза, кусочки геля, содержащие нужные полосы, инкубируют в 10 мМ фосфате натрия (рН 7,2), содержащем 0,1%-ный ДСН, в течение 24 ч при 37 "С, чтобы элюировать белки. Можно также обработать высушенные фрагменты геля 6,0 ? мочевиной, 0,5%-ным ДСН. Раство-

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

307

Таблица 14. Триптическое расщепление продуктов трансляции

1. Добавьте панкреатическую рибонуклеазу до концентрации 25 мкг/мл и ЭДТА до конечной концентрации 50 мМ. Проинкубируйте 15 мин при 37°С (чтобы гидролизовать тРНК в составе пептидил-тРНК).

2. Осадите белки добавлением ТХУ до конечной концентрации 5%. Проинкубируйте 30 мин во льду.

3. Осадите осадок центрифугированием (2000g\ 5 мин) и промойте его 5%-ным ТХУ, затем смесью этанола с эфиром (2:3, по объему) и, наконец, эфиром.

4. Проведите окисление белка с помощью надмуравьиной кислоты или проведите реакцию аминоэтилирования.

Окисление надмуравьиной кислотой

Вначале смешайте 950 мкл муравьиной кислоты с 50 мкл 30%-ной перекиси водорода и проинкубируйте 2 ч при комнатной температуре. Тем временем высушите белок и растворите его в смеси муравьиной кислоты с метанолом (5 : 1, по объему) в концентрации 1 мг белка в 60 мкл смеси. После этого добавьте 100 мкл смеси муравьиной кислоты с перекисью водорода на 1 мг белка. Проинкубируйте 2,5 ч при 0 "С. Добавьте 2 мл воды на 1 мг белка и лиофилизуйте в течение ночи. Аминоэтилирование

Растворите осадок в 8 ? деионизованной мочевине1, 5 мМ ЭДТА, 0,19 ? 2-меркаптоэтаноле, 0,5 ? трис-HCl (рН 8,6) в концентрации ~15 мг белка в 1 мл. Перед добавлением в пробирку с белком через этот раствор следует в течение 5 мин пропускать аргон. Проинкубируйте раствор белка 2 ч при комнатной температуре. Затем добавьте 25 мкл этиленимина на 1 мл и проинкубируйте еще 2 ч. Осадите и промойте белок, как указано в пп. 2 и 3, и лиофилизуйте осадок белка.

5. Растворите осадок после проведения реакции 4 в 0,1 ? бикарбонате аммония, рН 8,9, добавьте трипсин (соотношение фермент: субстрат равно 1 : 100 по весу) и проинкубируйте 5 ч при 37 °С. Через 2 ч инкубации добавьте еще столько же трипсина.

6. Лиофилизуйте образец и растворите его в минимальном объеме воды для дальнейшего анализа триптических пептидов (разд. 5.4).

1 Деионизуйте мочевину, пропустив раствор через колонку со смешанной смолой Bio-Rad AG 501-х8. Можно использовать ультрачистую мочевину (ultra-pure), которая яе требует дополнительной очистки.

ренные белки осаждают затем ТХУ в присутствии БСА-носите-л;я (100 мкг/мл) и обрабатывают, как описано в табл. 14.

Триптические пептиды можно проанализировать с помощью двумерного разделения в тонком слое силикагеля на пластинках 20x20 см [23] или на хроматографической бумаге Whatman ЗММ [24], проведя в первом направлении высоковольтный электрофорез [400 В, 3—4 ч, в буфере, состоящем из водного раствора пиридина и уксусной кислоты при рН 6,5 (474 мл воды : 25 мл пиридина : 1 мл уксусной кислоты) или при рН 3,5 (289 мл воды : 1 мл пиридина : 10 мл уксусной кислоты)], а во втором направлении хроматографию в смеси бутанол—уксусная кислота—вода (3:1:1, по объему). Радиоактивные пятна выявляют с помощью радиоавтографии. Можно также разделить пептиды с помощью ионообменной хроматографии на колонке

20·

308

Глава 9

0,9X16 см со смолой Aminex-S (фирма Bio-Rad) и определить радиоактивность фракций [25]. Последний метод особенно информативен в сочетании с двойным изотопным мечением. Например, продукт трансляции, меченный in vitro 3Н, смешивают с аутентичным белком, меченным 35S; тогда соотношение изотопов в колоночных фракциях покажет, происходит ли совместное разделение триптических пептидов, подтверждая или опровергая тем самым их идентичность.

5.5. Расшифровка аминокислотной последовательности

Специфические продукты трансляции очищенных индивидуальных мРНК можно также охарактеризовать и количественно определить путем расшифровки их ?-концевых аминокислотных последовательностей [26]. Правда, это дорогая процедура, требующая большого количества радиоактивных аминокислот и прибора для секвенирования белков с высокой чувствительностью. Сходный метод, особенно ценный для изучения участков инициации в мРНК, — синтез коротких инициаторных пептидов с меченым ?-концевым [ЗБ5]-метионином. Чтобы ограничить синтез белка несколькими первыми аминокислотами, в бесклеточную систему добавляют какой-нибудь ингибитор элонгации цепи, например спарсомицин, и используют довольно малые времена инкубации [27]. Пептидил-тРНК экстрагируют фенолом в присутствии РНК-носителя и осаждают этанолом. Затем образцы подвергают полному гидролизу рибонуклеазой, лио-филизуют и меченые пептиды разделяют с помощью высоковольтного электрофореза на бумаге при рН 3,5 [28]. Пятна выявляют радиоавтографией и идентифицируют, сравнивая их по подвижности со стандартными метионил-пептидами.

5.6. Анализ биологической активности

Наконец, продукты трансляции можно идентифицировать по их биологической активности. Правда, это удается лишь в редких случаях, так как в бесклеточных системах синтезируется ничтожное количество белков. Тем не менее, если фермент или какой-либо другой белок имеет достаточно высокую специфическую биологическую активность, его синтез можно количественно оценить путем прямого определения этой активности. Для успешного применения этого подхода нужно, чтобы все посттрансляционные модификации, необходимые для функционирования белка, осуществлялись in vitro (разд. 6). В качестве примеров, когда этот подход оказался полезным, можно привести трансляцию в лизате ретикулоцитов мРНК, кодирующих ?-интерферон [29] и тимидинкиназу вируса осповакцины [30].

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

309

6. Процессинг продуктов трансляции

С помощью бесклеточных систем синтеза белка можно не только идентифицировать первичные продукты трансляции. В соответствующих условиях в таких системах происходит ряд посттрансляционных модификаций первичных продуктов, в том числе протеолитическое расщепление, гликозилирование, ацети-лирование и фосфорилирование специфических участков. В настоящем разделе описаны некоторые методы изучения всех этих реакций.

6.1. Сигнальные последовательности

В работах по бесклеточной трансляции [31, 32] были получены многочисленные данные о существовании ?-концевых последовательностей, играющих роль сигналов, обусловливающих внедрение или перенос определенных белков через мембраны эндоплазматического ретикулума. Такой перенос характерен для биосинтеза многих секретируемых и мембранных белков. Процесс начинается на самых ранних этапах синтеза полипептида, когда растущая полимерная цепь «выходит» из рибосомы. Не вызывает сомнения, что внедрение новообразованных полипептидов в мембраны играет большую роль в связывании полисом с мембранами шероховатого ретикулума. Длина сигнальных последовательностей составляет обычно 20—30 аминокислот, они содержат гидрофобные участки и в большинстве случаев отщепляются под действием фермента, локализованного в мембране, до завершения синтеза полипептидной цепи.

Чтобы исследовать эти процессы in vitro, необходимо приготовить не только мРНК, кодирующие соответствующие белки, и системы для их трансляции, но также мембраны, узнающие сигнальные последовательности. Следует также обратить внимание на выбор подходящих условий инкубации и разработку методов идентификации сигнальных последовательностей и обнаружения переноса новообразованных цепей внутрь мембранных везикул.

6.1.1. Выделение микросомных мембран

В табл. 15 описан метод выделения микросомных мембран из поджелудочной железы собаки (ранее ткань этой железы чаще использовали при исследовании процессинга новообразованных секретируемых белков in vitro). В результате получаются препараты, свободные от нуклеазной активности и обладающие высокой процессирующей активностью. Измельченную ткань поджелудочной железы гомогенизируют и получают с помощью дифференциального центрифугирования в сахарозе фрак-

310

Глава 9

Таблица 15. Получение микросомных мембран, свободных от полисом, из поджелудочной железы собаки [35]

Получение мембран микросом с присоединенными к ним полисомами

1. Извлеките поджелудочную железу собаки хирургическим путем и поместите ее в холодный буфер ТКМ (50 мМ триэтаноламин, рН 7,5, 50 мМ КС1, 5 мМ MgCI2), содержащий 0,25 ? сахарозу.

2. Удалите соединительную и жировую ткани, а также крупные кровеносные сосуды. Нарежьте поджелудочную железу на кусочки и пропустите их через пресс из нержавеющей стали (диаметр отверстия 1 мм).

3. Добавьте два объема буфера ТКМ, содержащего 0,25 ? сахарозу, и гомогенизируйте ткань в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком с мотором (5—10 движений пестика при 40