Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

0 об/мин).

4. Отцентрифугируйте 10 мин при 13000g при 4 °С.

5. Соберите супернатант и наслоите его на ступенчатый сахарозный градиент (1,5, 1,75 и 2,2 ? сахарозы, по 5 мл каждого раствора) в ТКМ-буфере.

6. Отцентрифугируйте 24 ч при 140 000g при 4 °С.

7. Отберите слой 1,75 ? сахарозы (микросомы с присоединенными к ним полисомами). Разведите препарат равным объемом буфера ТКМ и наслоите на 2 мл 1,3 ? сахарозы в том же буфере.

8. Отцентрифугируйте 30 мин при 100 000g при 4 °С.

9. Слейте супернатант. Осадок (препарат микросом с полисомами) можно хранить при —70 "С1.

Получение микросом, свободных от полисом

10. Ресуспендируйте осадок микросом с присоединенными к ним полисомами в ТК-буфере (50 мМ триэтаноламин-HCl, рН 7, 5, 50 мМ КС!) в концентрации 100 ед. А2т в 1 мл. Добавьте 0,2 ? ЭДТА (рН 7,0) из расчета 3 мкмоль ЭДТА на 10 ед. Л2И микросом с полисомами.

11. Наслоите аликвоты по 0,5 мл на градиенты 10—55% сахарозы объемом 12,5 мл в буфере ТКМ и отцентрифугируйте 2 ч при 190 000g при 4 °С.

12. Соберите содержимое мутной полосы, расположенной в области 40—45% сахарозного градиента (микросомы, свободные от полисом) и разведите препарат двумя объемами ТК-буфера.

13. Отцентрифугируйте 30 мин при 100 000g при 4 "С.

14. Слейте супернатант и храните осадок при —70 °С.

15. Перед использованием ресуспендируйте осадок с помощью непродолжительной обработки ультразвуком в следующем буфере:

0,25 ? сахароза 0,1 ? КС1 3 мМ MgCl2 2 мМ ДТТ

20 мМ HEPES (доведите рН до 7,3 раствором КОН)

Для дальнейшей очистки этого препарата его можно пропустить через сефарозу

цию микросом. Если это необходимо, мембраны освобождают от эндогенных полисом с помощью обработки ЭДТА и повторно пропускают через градиент сахарозы (табл. 15). В работе [33] использовалась также обработка пуромицином в 0,5 ? КС1. Подобные препараты микросомных мембран, обладающие способностью узнавать сигнальные последовательности и отщеплять их, можно получить и из печени крысы или из клеток ас-цитной опухоли [34]. Поскольку какая-либо специфичность в узнавании сигнальных последовательностей микросомными

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

311

мембранами отсутствует, оба этих источника, по-видимому, одинаково пригодны. Однако относительная активность препаратов и степень рибонуклеазного загрязнения могут колебаться в зависимости от источника, и их следует проверить, прежде чем использовать эти мембраны для повседневной работы.

6.1.2. Условия инкубации для проведения процессинга

Условия, при которых мРНК транслируются, а их продукты подвергаются процессингу под действием добавленных препаратов микросомных мембран, в основном такие же, как это было описано ранее, в разд. 2—4. В некоторых случаях при анализе протеолитического расщепления под действием мембран в реакционные смеси включают ингибиторы протеаз типа пепстатина, химостатина, антипаина, лейпептина или трасилола [35]. Сами мембраны добавляют в концентрации 5 ед. Лгво в 1 мл. Часто отмечалось, что высокие концентрации мембран (необходимые для полного завершения процессинга) ингиби-руют общий синтез белка; этот эффект сильнее выражен в системе из зародышей пшеницы, чем в лизате ретикулоцитов, обработанном микрококковой нуклеазой. Выбор времени инкубации зависит от кинетики синтеза белка и посттрансляционного процессинга. Если вскоре после начала реакции подавить новую инициацию, можно синхронизировать процессинг и выяснить, как он связан во времени с инициацией. Для этого применяют специфические агенты, например m7GMP или эдеин [36]. Точно так же в условиях in vitro можно изучать судьбу предсуществующих новообразованных полипептидных цепей в полисомах, связанных с ретикулумом (если они не были отмыты с помощью ЭДТА). Для этого инициация должна быть полностью блокирована, и тогда происходит только элонгация полипептидов, т. е. система работает в режиме «соскальзывания» («run-off») рибосом [37].

6.1.3. Изучение переноса белков через мембраны и отщепления сигнальных последовательностей

На существование дополнительных ?-концевых сигнальных последовательностей указывал тот факт, что первичные продукты трансляции мРНК, кодирующих секреторные белки, несколько длиннее, чем сами эти белки [31, 32]. Присутствие дополнительных 20—30 аминокислот в молекуле белка как раз достаточно, чтобы отличить их от продукта нормальной длины при электрофорезе в ПААГ—ДСН, в частности, для таких небольших белков, как препроинсулин и претрипсиноген. Таким образом, электрофоретическая подвижность является простым

312

Глава 9

тестом на присутствие сигнальной последовательности [33]. Следует, однако, заметить, что дополнительные модификации первичного продукта трансляции, особенно интенсивное глико-зилирование, также могут приводить к изменению электрофо-ретической подвижности (причем иногда непредсказуемым образом). Поэтому наиболее надежное доказательство наличия ?-концевой последовательности или ее отщепления во время трансляции in vitro состоит в прямом определении аминокислотной последовательности радиоактивно меченного белка с помощью автоматической процедуры Эдмана. Присутствие или отсутствие ?-концевого метионина не является указанием на отщепление сигнальной последовательности, так как инициирующая аминокислота обычно отщепляется вскоре после начала элонгации полипептидной цепи. Следует также отметить, что во многих системах синтеза in vitro возможно ацетилиро-вание ?-концевого остатка новообразованной полипептидной цепи, что затрудняет секвенирование. Для того чтобы подавить реакции ацетилирования, проводят истощение реакционных смесей по эндогенному ацетил-СоА, добавляя 1 мМ оксалоацетат и цитратсинтазу в концентрации 25 ед/мл.

Отщепление сигнальных последовательностей идет обычно сопряженно с трансляцией, одновременно с переносом образующихся полипептидов через микросомные мембраны. Поскольку белки сосредоточиваются при этом внутри микросомных везикул, они оказываются защищенными от протеаз. На этом основан метод регистрации актов переноса белков. В конце трансляции в бесклеточную систему добавляют смесь трипсина и химотрипснна (по 50 мкг/мл) и инкубируют 3 ч при 0—2°; при этом разрушаются все продукты реакции, находящиеся вне везикул. После осаждения ТХУ, электрофореза в ПААГ—ДСН и радиоавтографии или флюорографии можно определить, какие белки в этих условиях оказались устойчивы к протеолизу. Опыт должен включать негативный контроль (без обработки протеазой) и позитивный контроль (протеазная обработка реакционной смеси после добавления детергента).

В последние годы в исследовании переноса белков через мембраны in vitro был достигнут значительный успех. Например, оказалось возможным солюбилизировать сигнальную пеп-тидазу путем обработки мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума детергентами. Этот фермент ингибируется химостатином. Было также показано, что белок, узнающий сигнальную последовательность, связан с эндоплазматический ретикулумом и участвует в избирательном связывании образующихся секреторных белков с мембранами при трансляции in vitro [35]. Этот белок в растворенном виде способен блокировать элонгацию полипептидных цепей, содержащих сигнальные

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

313

последовательности; в составе мембран он не оказывает такого действия. Все это свидетельствует об очень важной роли бесклеточных систем трансляции в изучении механизмов переноса белков через мембраны. К счастью, сигнальные последовательности и компоненты системы переноса, по-видимому, универсальны, что и способствовало успеху всех этих исследований. Так, мембраны из поджелудочной железы собаки с успехом использовались в системе из зародышей пшеницы при трансляции мРНК из столь экзотического источника, как островки поджелудочной железы морского черта [38].

6.2. Протеолиз первичных продуктов

Помимо отщепления ?-концевых сигнальных последовательностей в присутствии микросомных мембран первичные продукты трансляции могут участвовать в бесклеточных системах и в других актах протеолитического процессинга. С этим чаще всего сталкиваются в случае «полибелков» ряда вирусов животных и растений, которые синтезируются в результате полной трансляции больших мРНК. Расщепление полипептидной цепи может происходить во многих специфических сайтах первичного продукта трансляции [19, 39]. Участвующие в этом протеазы представляют собой растворимые ферменты, отличные от связанной с мембранами сигнальной пептидазы; они могут присутствовать в системах трансляции в качестве эндогенного компонента (например, в лизате ретикулоцитов) [39]. Иногда они сами являются продуктами трансляции вирусной мРНК, которые образуются in vitro во время инкубации [39].

Для изучения кинетики сопряженного с трансляцией и посттрансляционного процессинга новообразованных продуктов в бесклеточных системах лучше всего следить за появлением и исчезновением определенных полипептидов с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН и радиоавтографии или флюорографии материала, меченного [355]-метионином. Многие эксперименты основаны на импульсном мечении и импульсном разведении метки (для разведения используют избыток немеченого метионина) в течение различных промежутков времени. Добавление ингибиторов инициации, например эдеина или аналогов «кэпа», вскоре после введения мРНК позволяет синхронизировать инициацию белкового синтеза [36]. Если радиоактивную аминокислоту добавить после ингибитора инициации, то пометятся преимущественно пептидные последовательности вблиз С-конца продукта трансляции. Если вместо метионина использовать Кт-формил-[355]-метионил-тРНКг (разд. 7.1.1 и 7.2.1), то пометятся исключительно ?-концевые пептиды. Чтобы блокировать процессинг первичных продуктов трансляции, можно использо-

.314

Глава 9

вать специфические ингибиторы протеаз. С другой стороны, можно стимулировать протеолиз, если в системы трансляции добавлять клеточные экстракты, содержащие большое количество соответствующих ферментов. Именно этот подход часто применяется, когда для осуществления процессинга синтезир

страница 71
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2019)