ованных in vitro вирусных белков добавляют гомологичные экстракты зараженных вирусом клеток [19].

При интерпретации картины распределения меченых полипептидов, полученной после электрофореза в ПААГ—ДСН, нужно быть весьма осмотрительным. Поскольку в некоторых 'бесклеточных системах наблюдается тенденция к преждевременной терминации синтеза полипептидов (разд. 4.6), при трансляции крупных индивидуальных мРНК может образоваться сложный набор продуктов (см., например, рис. 4). Появление таких неполных белков усложняет анализ продуктов протео-литического процессинга больших полибелков с образованием отдельных мелких белков или даже делает его невозможным. В системе лизата ретикулоцитов такой проблемы практически не возникает, поэтому она лучше всего подходит для большинства исследований этого типа.

7. Исследование регуляции трансляции с помощью бесклеточных систем

Эта глава посвящена в основном использованию бесклеточных белоксинтезирующих систем для изучения трансляции экзогенных мРНК. и образующихся при этом продуктов, но такие системы можно использовать и для изучения самого механизма синтеза белка и его регуляции. В этой области накоплено огромное количество данных. Ниже приводятся некоторые примеры подобных исследований.

7.1. Лизат ретикулоцитов

Благодаря своей высокой активности система лизата ретикулоцитов была наиболее популярной моделью для изучения механизма синтеза белка у эукариот и многих аспектов регуляции трансляции. Ее популярности способствовали низкая эндогенная рибонуклеазная активность, высокое содержание рибосом и факторов инициации и тот факт, что основные продукты трансляции были хорошо охарактеризованы. К счастью, трансляция в лизате ретикулоцитов зависит от различных регуляторных факторов, например от присутствия гемина и низких концентраций двухцепочечной РНК; влияние этих факторов можно исследовать более подробно. Но чтобы говорить об универсальности полученных выводов, следует выяснить, насколько эта специализированная клетка типична для эукариотических клеток.

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

315

7.1.1. Образование комплексов инициации

В системе лизата ретикулоцитов можно сравнительно легко исследовать сборку различных комплексов, участвующих в инициации белкового синтеза: связывание инициаторной аминоаци-лированной метиониновой тРНК с фактором инициации eIF-2 в присутствии GTP, последующую ассоциацию такого тройного комплекса с нативной 405-субчастицей и мРНК-зависимое присоединение бОБ-субчастицы с образованием SOS-комплекса инициации. В любом случае исследование надо начинать с получения [355]-метионил-тРНК1. Для этого берут неочищенную смесь аминоацил-тРНК—синтетаз из Escherichia coli и деацилирован-ные тРНК из печени кролика. В табл. 16 описана методика получения ферментов, в табл. 17 — методика получения [35S]-метионил-тРНК- Из всех тРНК млекопитающих бактериальные синтетазы способны ацилировать только тРНК{Ме1. После быстрой экстракции фенолом и диализа в течение ночи получается препарат метионил-????? с радиоактивностью (2—5) · 104 имп/мин на 1 мкл. Если надо провести дополнительную очистку метионил-тРНК (например, удалить тРНКтМе1 и примеси ингибиторов типа сульфатированных полисахаридов), это удобно сделать с помощью хроматографии на небольшой колонке с ДЭАЭ-цел-

Таблица 16. Выделение препарата аминоацил-тРНК — синтетаз Е. coli [61]

1. Разотрите 5 г лиофилизированных клеток Е. coli с 15 г окиси алюминия (тип 305) в присутствии достаточного количества буфера, чтобы получилась паста. Буфер содержит 10 мМ MgCl2, 10%-ный глицерол и 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.

2. Добавьте еще один объем буфера и отцентрифугируйте 5 мин при 700g, чтобы удалить окись алюминия.

3. Отцентрифугируйте супернатант 2 ч при 100 OOOg.

4. Нанесите супернатант на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1x9 см), уравновешенную буфером для элюции:

20 мМ 2-меркаптоэтанол

1 мМ MgCl2 10%-ный глицерол

20 мМ КН2Р04 (доведите рН до 7,5 раствором КОН)

5. Промойте колонку буфером для элюции, чтобы удалить несвязавшиеся белки.

6. Элюируйте аминоацил-тРНК —синтетазы буфером для элюции, в котором концентрация КН2Р04 увеличена до 0,25 ? (доведите рН до 6,5 раствором КОН). ?

7. Соберите белок в пике и отдиализуйте его против следующего буфера:

40 мМ 2-меркаптоэтанол 10%-ный глицерол 15%-ный ПЭГ-6000

2 мМ КН2Р04 (доведите рН до 7,0 раствором КОН).

8. Добавьте к препарату равный объем глицерола и храните при —20 °С. Met-TPHKf — синтетаза в этих условиях остается активной в течение долгого времени.

316

Глава 9

Таблица 17. Получение [35S]-Met-TPHKf

1. Разведите следующие компоненты в конечном объеме 1 мл:

50 мМ КС1 8 мМ ацетат магния 2 мМ ДТТ ' 4 мМ АТР 1 мМ СТР

100 мкКи [35S]-метионина (1100—1300 Ки/моль)

50 мМ HEPES (доведите рН до 7,5 раствором КОН)

1 мг деацилированной тРНК из печени теленка (Boehringer)

80 мкл препарата аминоацил-тРНК — синтетаз Е. coli1

2. Проинкубируйте 30 мин при 30 °С, затем охладите во льду, добавьте 0,1 мл 2 ? ацетата натрия (рН 4,4) и 2 мл водонасыщенного фенола. Интенсивно встряхивайте в течение 5 мин при 4 °С.

3. Отцентрифугируйте 10 мин при 4QQg и отберите верхний (водный) слой.

4. Еще раз экстрагируйте фенольный слой, встряхивая его с 0,8 мл 50 мМ ацетата натрия, рН 5,0, 5 мМ ацетата магния.

5. Отцентрифугируйте, как указано в п. 3. Отберите водный слой и объедините с предыдущей водной фазой, полученной на этапе 3.

6. Проведите одну из следующих процедур.

а. Диализуйте объединенные водные фазы в течение 6 ч против 0,5 ? NaCl, 50 мМ ацетата натрия, рН 5,0, затем в течение 17 ч —против 20 мМ ацетата натрия, рН 5,0.

б. Осадите тРНК 2,5 объемами этанола при —20 °С, отцентрифугируйте 10 мин при lOOOOg, промойте осадок этанолом, высушите и растворите в 20 мМ ацетате натрия.

7. Храните препарат [35S]-Met-TPHKt аликвотами по 0,1 мл при —70 °с.

1 Приготовление этого препарата описано в табл. 16.

люлозой или с бензоилированной ДЭАЭ-целлюлозой. В последнем случае препарат метионил-тРНК. наносят на колонку в буфере, содержащем 0,4 ? NaCl при рН 5,0, и элюируют очищенную Met-TPHKt, увеличив концентрацию соли до 0,5 М. Можно элюировать фракции и градиентом соли 0,4—1,0 М.

Если нужна ?-формилметионил-тРНКл (например, для того, чтобы пометить ?-концы новосинтезированных белков без последующего отщепления инициирующей аминокислоты), в реакционную смесь для аминоацилирования тРНК, состав которой указан в табл. 17, п. 1, добавляют 10 мкМ Са-лейковорин (фолиновую кислоту в 0,25 ? НС1). Фолиновая кислота служит донором формильной группы в реакции, катализируемой еще одним ферментом, присутствующим в препарате синтетаз из Е. coli. В этих условиях формилируется 70—80% метионил-тРНК.

За связыванием [355]-метионил-тРНК в составе тройного комплекса с eIF-2 и GTP можно следить в безрибосомных су-пернатантах лизатов ретикулоцитов по задержке радиоактивности на нитроцеллюлозных фильтрах [40]. Некоторые особенности такого связывания характерны только для eIF-2, и их

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

317

0,15

0,05

20 0

Номео аюакции

Рис. 5. Образование комплексов инициации 403-субчастица-метионил-тРНК1 в лизате ретикулоцитов. Инкубацию проводили в 150 мкл в условиях синтеза <5елка (табл. 4), но с добавлением циклогексимида (100 мкг/мл). Меченый предшественник [358]-метионил-тРНК( (2,22-105 имп/мин) добавляли после предынкубации лизата в течение 35 мин при 30 °С. Через 2 мин реакцию останавливали, добавляя холодный буферный раствор (25 мМ КС1, 10 мМ NaCl, 1 мМ ацетат магния, 0,25 мМ ДТТ, 10 мМ трис-HCl, рН 7,6). Образцы центрифугировали через градиент сахарозы объемом 12,5 мл (20—40%) в том же буфере в течение 4,5 ч при 205 000 g. Градиент раскапывали на фракции, осаждали 1 мл 2%-ного (вес/объем) бромистого цетилтриметилам-мония в присутствии 0,5 мг дрожжевой РНК-носителя, фильтровали через •стекловолокнистые фильтры CF/C и определяли радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Положение 40S- и 605-субчастиц, вОБ-рибосом, димер-ных и тримерных полисом отмечено стрелками. А — контрольный лизат, Б — лизат, предынкубированный с препаратом репрессора, контролируемого гемом. Обратите внимание на присутствие комплексов инициации метионил-????? с 40S- и вОБ-субчастицами в опыте А. Они седиментируют в зоне •с большей плотностью, образуя плечо у соответствующих пиков оптической плотности Л2бо- Связывание метионил-????? с этими комплексами сильно ингибируется контролируемым гемом репрессором (действие которого основано на фосфорилировании фактора инициации eIF-2).

следует проверить, чтобы подтвердить специфичность связывания.

1. Связывание должно быть специфично для метионил-тРНКь

2. Образование комплекса должно зависеть от GTP и сильно ингибироваться GDP.

3. Фосфоенолпируват вместе с пируваткиназой, участвующие в регенерации GTP из GDP, увеличивают скорость и глубину реакции.

Чтобы изучить следующий этап процесса инициации — образование 405-комплекса, — необходимо после инкубации фракционировать лизат в градиенте сахарозы. В подписи к рис. 5 описаны условия центрифугирования. Поскольку во время синтеза белка происходит быстрый обмен в комплексах 40S-eIF-2-•метионил-?????, для максимального мечения этих комплексов

318

Глава 9

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах_319

достаточно проинкубировать смесь с [355]-метионил-тРНК в течение всего 2 мин. Однако при нормальных условиях трансляции стационарная концентрация этих комплексов весьма мала; для ее увеличения можно блокировать элонгацию полипептидов, например циклогексимидом (см. подпись к рис. 5). В этих условиях происходит накопление 405-комплексов, поскольку они не могут участвовать в синтезе белка, причем концентрация этих комплексов определяется, по-видимому, количеством активного eIF-2 в системе.

.В условиях синтеза белка иниииаторные 405-комплексы быстро переходят в более крупные комплексы, и каждый из них ассоциирует с какой-нибудь молекулой мРНК и 60S-cy6-частицей. В обычном лизате большая часть мРНК находится в составе полис