ом, поэтому обнаружить образование комплекса 80S-Met-TPHKrMpHK трудно. Но когда элонгация подавлена, можно превратить 405-комплексы в 805-комплексы добавлением экзогенной мРНК. Этот подход лежит в основе так называемого метода «смещения равновесия», описанного в работе [41]. Элегантность этого метода состоит в том, что он позволяет определять связывание мРНК, используя в качестве меченого соединения [355]-метионил-тРНК. Конечно, если есть радиоактивно меченная РНК, можно использовать и ее; еще один способ обнаружения poly(A)+-PHK состоит в гибридизации с [3Н]-poly(U) [42]. В этих случаях для разделения и количественного определения образовавшихся комплексов также используют центрифугирование в градиенте сахарозы (рис. 5).

7.1.2. Механизмы действия ингибиторов белкового синтеза

Система лизата ретикулоцитов широко использовалась для изучения механизмов действия ингибиторов белкового синтеза in vitro. В частности, много внимания было уделено действию специфических протеинкиназ, например репрессору, который регулируется гемом, и ингибитору, который активируется двух-цепочечной РНК [43]. Эти ферменты подавляют инициацию синтеза полипептидной цепи, фосфорилируя а-субъединицу eIF-2 с мол. массой 38 кДа. Кроме того, они подвергаются автофосфорилированию. Эти реакции фосфорилирования легко обнаружить, если проинкубировать лизаты в присутствии [у-32Р]-АТР и проанализировать меченые белки с помощью одно- или двумерного электрофореза в ПААГ и/или изоэлект-рического фокусирования с последующей радиоавтографией [44]. Эти методы позволяют работать с полными лизатами [44], с фракцией, осажденной при рН 5 [45], или с eIF-2, частично очищенным хроматографией на фосфоцеллюлозе [46]. Действие киназ eIF-2 на инициацию изучали с помощью подходов, описанных в разд. 7.1.1.

Седиментация

Рис. 6. Деградация полисом под действием эндонуклеазы, активируемой 2',5'-олигоаденилатом в лизате ретикулоцитов. .4. Лизаты инкубировали 25 мин при 30 °С в реакционной смеси объемом 100 мкл в присутствии всех компонентов, необходимых для синтеза белка, но с добавлением циклогек-симида в концентрации 100 мкг/мл. Б. Реакционная смесь имеет тот же состав, что и в опыте А, но с добавлением 2',5'-олигоаденилата (15 нМ). Инкубацию прерывали добавлением 250 мкл ледяного буфера (0,1 ? КС1, 5 мМ ацетат магния, 20 мМ трис-HCl, рН 7,6) и образцы анализировали центрифугированием в градиентах сахарозы объемом 5 мл (20—50%) в том же буфере (35 мин при 233 OOOg). Для измерения оптической плотности при 260 нм градиенты пропускали через проточный денситометр (длина оптического пути 10 мм, объем кюветы 80 мкл). Пики, соответствующие положению одиночных рибосом и полисом, содержащих 2—5 рибосом, отмечены стрелками на рис. Б. Обратите внимание, что под действием 2',5'-олигоаденилатзависи-мого расщепления полисомы, содержащие в основном 4—5 рибосом, превращаются в структуры из 1—3 рибосом. Подробнее см. в работе [47].

Другой класс ингибиторов с совершенно другим механизмом действия — ряд 2/,5'-олигоаденилатов. Механизм ингибирования (путем активации специфической эндонуклеазы [47]) можно продемонстрировать с помощью следующего эксперимента. Лизаты инкубируют в присутствии высоких концентраций цикло-гексимида или эметина, чтобы предупредить распад полисом из-за «соскальзывания» рибосом, и анализируют полисомы центрифугированием в градиенте сахарозы. Рис. 6 демонстрирует, как в этих условиях под действием 2',5'-олигоаденилата уменьшается размер полисом. Чувствительность синтеза белка к ин-гибированию двухцепочечной РНК в системе лизата ретикулоцитов объясняется тем, что в ней содержится некоторое количество эндогенной 2/,5'-олигоаденилатсинтетазы, а также eIF-2-киназа, активируемая двухцепочечной РНК.

Помимо уже упомянутых гемина и двухцепочечной РНК, лизаты ретикулоцитов на удивление чувствительны к некоторым

320

Глава 9

типам веществ. Среди них следует отметить окисленные тиолы, которые ингибируют трансляцию по механизму, сходному с тем случаем, когда в системе не хватает гемина. К ингибиторам синтеза белка в ретикулоцитах относятся также различные низкомолекулярные РНК с неустановленной функцией, аналоги «кэпа» на 5'-концах большинства мРНК [50], а также ДНК, комплементарные присутствующим в системе мРНК и блокирующие их использование по механизму, названному «трансляцией, остановленной образованием гибрида» (hybrid-arrested translation) [51].

Описанные выше подходы позволяют подробно исследовать действие всех этих агентов, а также любых других ингибиторов белкового синтеза. При интерпретации результатов экспериментов следует руководствоваться следующими общими соображениями.

1. Ингибиторы инициации вызывают распад полисом только в условиях синтеза белка.

2. Ингибиторы элонгации и терминации нарушают синтез белка, не вызывая распада полисом, и могут даже стимулировать образование более крупных полисом, чем в контроле («рибосомная перегрузка»).

3. Эндонуклеазы вызывают распад полисом независимо от того, идет ли синтез белка.

7.2. Экстракты культур клеток и тканей

Для многих работ по трансляции система лизата ретикулоцитов непригодна. Как отмечалось в разд. 7.1, ретикулоциты не обязательно отражают типичные свойства всех эукариотических клеток в отношении регуляции трансляции. Ведь они представляют собой, в конце концов, высокоспециализированные клетки. К тому же они не отвечают на многие физиологические сигналы (например, на гормоны), которые являются важными регуляторами функций в других клетках, и не могут использоваться для изучения вирусной инфекции. По этим причинам многие работы по регуляции трансляции проводятся на экстрактах других клеток, несмотря на определенные недостатки и трудности, присущие некоторым из этих систем (разд. 7.2.3).

7.2.1. Образование комплексов инициации

Бесклеточные системы, полученные из самых разнообразных клеток и тканей, с успехом использовались для исследования сборки комплексов инициации с участием нативных рибосомных 405-субчастиц и 805-рибосом, а также регуляции этой сборки. К настоящему времени эти исследования были прове-

Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных экстрактах

32Г.

10 15 0 5 Номер фракции

10 15

Рис. 7. Образование комплексов инициации 405-субчастица-метионид-тРНК в экстрактах клеток асцитной опухоли Эрлиха, растущих на полноценной' среде или в условиях дефицита аминокислот. Инкубацию проводили в 100 мкл в условиях синтеза белка на эндогенной мРНК (разд. 4.3). Концентрация L Sj-метионина 250 мкКи/мл. Через 2 мин инкубации при 30 °С реакцию-останавливали быстрым охлаждением и образцы центрифугировали в градиентах сахарозы объемом 5 мл (20-50%) 3 ч при 233 000 g Собирай фракции и определяли в них радиоактивность, как описано в подписи к рис. 5. Стрелками отмечено положение 40S- и бОБ-субчастиц и 80S-ph6ocom А — экстракт экспоненциально растущих клеток, получающих полноценное питание; 5 —экстракт клеток, голодавших по лизину в течение 30 мин перед получением экстракта. Обратите внимание на наличие меченого материала в верхней части градиента (свободная метионил-?????) и в нижней его части (новообразованные полипептидные цепи), а также в составе 40Э-комп-лексов. Аминокислотное голодание подавляет образование таких комплексов, путем инактивации фактора eIF-2. Подробнее см. в оригинальной работе [21]

дены на клетках асцитной опухоли Кребс II [52], асцитной опухоли Эрлиха [14, 21], мышиных L-клетках [47], клетках HeLa [53], СНО [54], миеломы [53], нормальных и стимулированных митогенами лимфоцитах [55], клетках печени и мышц (С. Harmon, V. ?. Pain, University of Sussex, неопубликованные данные) и на дрожжах [56]. По-видимому, во всех этих системах фактор инициации eIF-2 активен и способен связывать метио-нил-????? с 40Б-субчастицей. В некоторых случаях концентрация 405-комплексов становится сравнимой с их уровнем in vivo [14, 57]. Более того, нередко активность инициации в экстрактах отражает физиологические изменения, происходящие в клетках. Например, инициация синтеза белка в культурах клеток регулируется такими факторами, как нехватка незаменимых аминокислот, вирусная инфекция и обработка интерфероном, и все эти эффекты можно исследовать на соответствующих экстрактах

21-953

322

Глава 9

[58]. Во многих случаях добавление eIF-2 к бесклеточному экстракту обращает подавление инициации, вызванное физиологическими воздействиями. Сходные наблюдения были сделаны на экстрактах из мышц крысы, в которых инициация изменяется при диабете или голодании (С. Harmon, V. ?. Pain, University of Sussex, неопубликованные данные).

Для изучения этих явлений используют в основном те же методы, что и в случае лизата ретикулоцитов (разд. 7.1.1). Чтобы пометить in vitro 405-комплексы инициации (а в некоторых случаях и 805-комплексы), можно использовать [355]-метио-нил-тРНКл или свободный [35S]-MeTHOHHH. Если взять [35S]-метионин, эндогенные аминоацил-тРНК—синтетазы будут ами-ноацилировать и тРНКлМе', и тРНКтМе{, так что в условиях синтеза белка метка будет включаться также и в новообразованные полипептидные цепи. Однако их легко отделить от 405-комплексов центрифугированием в градиенте сахарозы. На рис. 7 показан результат типичного эксперимента, в котором с помощью этого метода сравнивали инициацию в экстрактах из клеток асцитной опухоли Эрлиха при содержании на полноценной среде и в условиях аминокислотного голодания. Следует отметить, что при использовании экстрактов, не подвергнутых диализу или фракционированию на сефадексе, удельная радиоактивность меченого метионина снижается из-за наличия эндогенного пула аминокислот. Следует ввести поправку на этот эффект, проведя эксперименты по изотопному разведению или по прямому аминокислотному анализу экстрактов.

7.2.2. Изучение трансляции матричной РНК

Бесклеточные системы из различных источников можно также использовать для изучения процесса трансляции в целом. Например, если речь идет об эндогенной мРНК, часто бывает необходимо определить, какую долю в синтезе составляет «до-использование» рибосом в предсуществовавших полисомах, а ка