Биологический каталог




Транскрипция и трансляция. Методы

Автор Б.Хеймс, С.Хиггинс

циты необходимо в дальнейшем фракционировать, их нельзя замораживать, так как процессы замораживания и оттаивания влияют на внутриклеточную компартментацию белков. Если содержимое ооцитов предполагается анализировать без фракционирования, их можно быстро заморозить в сухом льду и затем хранить при —20 °С.

5.2. Гомогенизация ооцитов

Если фракционировать ооциты не требуется, проведите следующие операции.

1. Гомогенизируйте свежие или замороженные ооциты в буфере для гомогенизации (табл. 7), добавляя 20—50 мкл буфера на ооцит.

2. Отцентрифугируйте в микроцентрифуге при 10 000 g.

3. Отберите супернатант, стараясь по возможности не захватить липидную пленку. Этот супернатант можно использовать непосредственно для электрофореза, добавив буфер для нанесения пробы (табл. 7), или провести сначала с ним иммунопре-ципитацию (разд. 5.4).

5.3. Фракционирование ооцитов с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы

Мембранные и секретируемые белки можно отделить от белков ядра и цитозоля с помощью ступенчатых градиентов сахарозы. Следует использовать свежевыделенные, незамороженные ооциты (разд. 5.1). В результате этой процедуры более 90% секретируемых белков оказывается во фракции мембранных эле-

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Хепоpus

351

Таблица 7. Растворы для гомогенизации и фракционирования ооцитов и для иммунопреципитации и электрофореза белковых продуктов

Буфер для гомогенизации

0,1 ? NaCl

1%-ный тритон Х-100

1 мМ PMSF1

20 мМ трис-HCl, рН 7,6 Т-буфер

50 мМ NaCl

10 мМ ацетат магния

1 мМ PMSF1 (если предстоит обработка протеазой, то этот компонент исключите)

20 мМ трис-HCl, рН 7,6 Буфер для иммунопреципитации

0,1 м ко

5 мМ MgCl2

1%-ный тритон Х-100

0,5%-ный ДСН

1% дезоксихолата натрия

1 мМ PMSF1

0,1 ? трис-HCl, рН 8,2

Чтобы приготовить этот буфер, смешайте компоненты в следующем порядке:

1 ? трис-HCl, рН 7,6 5,0 мл 1 ? КС1 5,0 мл

0,5 ? MgCl2 0,5 мл

100%-ный тритон Х-100 0,5 мл 10%-ный ДСН 2,5 мл

10%-ный раствор дезоксихолата натрия в воде (свежеприготовленный) 5 мл 100 мМ PMSF1 0,5 мл

Оттитруйте буфер NaOH до рН 8,2 и доведите объем до 50 мл Буфер для нанесения проб на гель для проведения электрофореза 1 ? сахароза

0,1%-ный бромфеноловый синий

5 мМ ЭДТА

2%-ный ДСН

0,2 ? трис-HCl, рН 8,8

1 0,1 ? исходный раствор PMSF в этаноле храните при —20 °С и добавляйте в буфер непосредственно перед его использованием.

ментов, представляющих собой фрагменты эндоплазматического оетикулума, аппарата Гольджи и плазматических мембран ооцита. Эта фракция мембранных элементов до некоторой степени загрязнена ядерными мембранами (хотя в ней нет примесей содержимого ядер). Подобного загрязнения можно избежать, если предварительно удалить из ооцитов ядра (разд. 6.1). Ниже описано два метода фракционирования в градиенте сахарозы (они представляют собой модификацию опубликованных методов [56]). При постановке опытов важно работать быстро и использовать охлажденные растворы.

352

Глава 10

5.3.1. «Ступенчатый» метод

1. -Гомогенизируйте примерно 20 ооцитов в 0,5 мл 10%-ного (вес/объем) раствора сахарозы в Т-буфере (табл. 7) с добавлением NaCl до конечной концентрации 0,15 М.

2. Наслоите гомогенат на ступенчатый градиент, состоящий из 1 мл 20%-ной (вес/объем) сахарозы, наслоенной на 1 мл 50%-ной (вес/объем) сахарозы (оба раствора на Т-буфере). Отцентрифугируйте 30 мин при 15 000 g в бакет-роторе.

3. После центрифугирования на поверхности градиента образуется липидная пленка. Слой 10%-ной сахарозы содержит компоненты цитозоля, а на границе между 10%-ной и 20%-ной сахарозой находятся главным образом митохондрии. На границе между 20%-ной и 50%-ной сахарозой обнаруживаются мембранные элементы, и именно здесь должны быть все мембранные и секретируемые белки. Тяжелые желтковые гранулы образуют осадок на дне. Отберите нужную фракцию пастеровской пипеткой. Эта процедура позволяет сохранить целостность мембран, если с ними необходимо проводить дальнейшие манипуляции, например опыты по защите от протеазы (разд. 6.4).

5.3.2. Метод «подушки»

Для многих целей более целесообразно осадить мембраны на дно. В этом случае действуйте, как описано в предыдущем разделе, но не подслаивайте 50%-ную сахарозу. В данных условиях мембраны оседают на дно вместе с желтком. Ресуспендируйте осадок в буфере для гомогенизации, чтобы солюбили-зировать мембраны и секретируемые белки, и белки желтка осадите центрифугированием в течение 1 мин в микроцентрифуге.

5.4. Обработка инкубационной среды

Если необходимо проверить присутствие секретируемых белков в среде инкубации с помощью иммунопреципитации и последующего гель-электрофореза (см. ниже), сначала осветлите среду центрифугированием в микроцентрифуге в течение 5 мин. Это позволяет удалить все загрязняющие среду бактерии; в противном случае они соосаждаются при иммунопреципитации.

5.5. Иммунопреципитация

1. К аликвоте пробы объемом 100 мкл (будь то гомогенат, фракция сахарозного градиента или осветленная культуральная среда) добавьте 400 мкл буфера для иммунопреципитации (табл. 7) и оставьте на 30 мин при 4°С.

Трансляция эукариотической мРНК в ооцитах Xenopus

353;

2. Добавьте антитела и оставьте еще на 30 мин при 4°С.

3. Добавьте 20 мкл 10%-ной (по объему) суспензии оболочек Staphylococcus aureus, обработанных формальдегидом (Pharmacia), и встряхивайте на качалке не менее чем 2 ч при 4°С.

4. Осадите фракцию оболочек в микроцентрифуге (20 с) и затем трижды промойте свежим буфером для иммунопреципитации.

5. Ресуспендируйте промытый осадок в 30 мкл буфера для электрофореза (табл. 7). Добавьте 1 мкл 0,1 ? ДТТ (исходный раствор ДТТ храните при —-20 °С), перемешайте и прокипятите в течение 3 мин.

5.6. Алкилирование и анализ белков с помощью электрофореза в ПААГ — ДСН в восстанавливающих условиях

Алкилирование — очень простая процедура, и ее рекомендуется проводить, чтобы избежать образования внутрицепочечных S—S-связей, которые могут возникать во время электрофореза и давать аномалии в картине электрофореза.

1. К 30 мкл пробы, растворенной в буфере для электрофореза (табл. 7), добавьте 5 мкл 0,5 ? иодацетамида (натриевая соль; раствор храните в аликвотах при — 70 °С). Оставьте на 20 мин при комнатной температуре.

2. Отцентрифугируйте 5 мин в микроцентрифуге, чтобы осадить весь бактериальный дебрис.

3. Нанесите пробу (супернатант) на пластинку ПААГ—ДСН, приготовленную для электрофореза в восстанавливающих условиях [74].

Результаты эксперимента с использованием методик, описанных в разд. 5.3—5.6, показаны на рис. 10.

5.7. Частичное алкилирование и анализ в ПААГ — ДСН без восстановления

Иногда, например при изучении тетрамерного иммуноглобулина [49], целесообразно алкилировать белки ооцита непосредственно во время гомогенизации, чтобы исследовать муль-тимерные белки в условиях, препятствующих их образованию из мономеров. Ниже приведена соответствующая методика.

1. Гомогенизируйте ооциты в буфере для гомогенизации, содержащем 0,1 ? иодацетамид (добавленный непосредственно перед опытом). Оставьте на 20 мин при комнатной температуре.

2. Осадите белки 5 объемами холодного ацетона и оставьте во льду на 10 мин.

3. Отцентрифугируйте 5 мин в микроцентрифуге и высушите осадок на воздухе.

4. Осадок ресуспендируйте в буфере для иммунопреципитации или для электрофореза и обработайте, как описано в

23—953

354

Глава 10

1 2 3 4 5 6 7 Мол. масса, к Да

-200

-69

>46

30

-14,3.

Рис. 10. Фракционирование ооцитов после микроинъекций. В ооциты вводили мРНК, кодирующие легкие (L) и тяжелые (Н) цепи иммуноглобулинов и метили белки [355]-метионином в течение 24 ч. Меченые ооциты фракционировали методом центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы (разд. 5.3.1) и затем проводили иммунопреципитацию и электрофорез в 12,5%-ном ПААГ в восстанавливающих условиях. Дорожки 1, 2 и 3 — иммунопреципитаты препаратов цитозоля, мембран и инкубационной среды соответственно. Дорожки 4 и 5 — иммунопреципитаты меченых клеток родительской миеломы и их инкубационной среды соответственно. На дорожке 6 показаны продукты трансляции иммуноглобулиновой мРНК, в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы. Виден предшественник легкой цепи (Lp). На дорожку 7 нанесены [14С]-маркерные белки. (Воспроизводится с разрешения авторов [49].)

разд. 5.4 и 5.5 соответственно; для электрофореза в ПААГ—ДСН ДТТ не добавляйте, так как он проводится в невосстанавливаю-щих условиях.

5.8. Двумерный гель-электрофорез

Ниже приведена методика двумерного гель-электрофореза. 1. Смешайте 20 мкл гомогената, препарата мембран, цитозоля или осветленной среды инкубации (если исследуемый бе-

.5 о

О Я О щ S

5 О

¦ ?» О

(С if) -

X

.....О,:;:

?

со

о s ?,

23*

356

Глава 10

лок секретируется) с 0,5 мл лизирующего буфера, содержащего 9,5 ? мочевину (квалификации ос. ч. ultrapure), 2%-ный (по объему) детергент нонидет Р-40, 20% -ные (по объему) амфо-лины (смесь одного объема амфолинов для диапазона рН 3,5— 10 и двух объемов для рН б—7), 5%-ный 2-меркаптоэтанол и 0,1%-ный ДСН. Если перед электрофорезом необходимо сконцентрировать фракции, то, прежде чем растворить образец в указанном лизирующем буфере, лиофилизируйте его. Иммуно-преципитаты можно растворять прямо в лизирующем буфере.

2. Отцентрифугируйте препарат в микроцентрифуге 10 мин.

3. Отберите прозрачный супернатант, проткнув пробирку сбоку иглой, чтобы не захватить плавающую на поверхности пленку липидов.

4. Этот супернатант без какой-либо дополнительной обработки нанесите на гели для разделения изоэлектрофокусиро-ванием.

На рис. 11 представлен пример двумерного разделения такого препарата.

6. Специальные методы

6.1. Энуклеация ооцитов

Ооциты лягушек относятся к числу редких клеток, у которых можно вручную удалить ядро. Энуклеация часто оказывается необходимой в таких экспериментах, когда вклад собственного аппарата транскрипции ооцита может усложнить интерпретацию данных. Кроме того, энуклеация представляет

страница 79
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Транскрипция и трансляция. Методы" (6.57Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)