4

--регуляторных факторов, участвующих в транскрипции 157

— очистка специфических РНК-

транскриптов 136—138

— процессинг предшественником

мРНК, метилирование 154—155 --.--полиаденилирование

151—154

---рРНК 156

---тРНК 156

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие редактора перевода ........... 5

Предисловие ................ 7

Введение Дж. Гердон.............. 8

Глава 1. Экспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих.

Д. Спандидос, Н. Уилки.......... 10

1. Введение............... 10

2. Методы введения ДНК в клетки млекопитающих . . . '. П

2.1. Кальций-фосфатная методика трансфекции..... 11

2.2. ДЭАЭ-декстрановый метод......... 24

2.3. Микроинъекция.......... .' . 26

2.4. Липосомы как переносчики генов........ 29

2.5. Слияние протопластов.........' 31

2.6. Другие методы переноса генов........ 32

2.7. Выбор метода переноса генов........ 32

3. Селектируемые маркеры.........\ ', 33

3.1. Биохимические маркеры.......... 33

3.2. Доминантные трансформирующие гены, изменяющие регуляцию роста............" 42

4. Векторы на основе вирусов.......... 43

4.1. Векторные системы на основе литических вирусов ... 44

4.2. Векторные системы на основе ретровирусов..... 44

4.3. Векторы на основе папилломавирусов...... 45

5. Экспрессия перенесенных генов ......... 48

5.1. Временная экспрессия........... 48

5.2. Стабильная трансформация......... 50

5.3. Изучение последовательностей, регулирующих транскрипцию 52

5.4. Индуцибельные гены........... 55

Благодарности.............. 61

Литература.............., 61

Глава 2. Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus. А. Кол.чен 65

1. Введение............ _ 65

2. Получение ооцитов и подготовка их к микроинъекции ... 68

3. Мнкроинъекция ДНК в ядра ооцитов........ 68

3.1. Необходимое оборудование......... 68

3.2. Конформация ДНК, используемой для инъекции ... 69

3.3. Стабильность инъецированной ДНК....... 69

3.4. Концентрация ДНК, используемая для инъекции ... 69

3.5. Заполнение микропипеток раствором ДНК..... 70

3.6. Микроинъекция............. 70

4. Радиоактивное мечение ооцитов после инъекции..... 74

4.1. Мечение РНК, транскрибированной на инъецированной ДНК 74

Оглавление

395

4.2. Мечение белков, кодируемых инъецируемой ДНК ... 75

5. Анализ РНК-транскриптов........... 75

5.1. Выделение РНК............ ']?

5.2. Характеристика РНК-транскриптов....... 77

5.3. Идентификация РНК-полимераз, участвующих в транскрипции 84

6. Анализ посттранскрипциоцного процессинга.....¦ 85

7. Использование системы ооцитов для исследований сопряженной транскрипции — трансляции.......... °°

8. Исследование регуляторных белков........ °'

Литература............... °'

Глава 3. Транскрипция генов эукариот в бесклеточных экстрактах.

Дж. Мэнли °9

1. Введение .............. ^

2. Получение и использование бесклеточного экстракта для транскрипции РНК-полимеразой II..........

2.1. Получение экстракта........... ™

2.2. Реакция транскрипции . . ....... 92

2.3. Выделение РНК..........¦ · ™

3. Анализ продуктов транскрипции РНК-полимеразой II 9*

3.1. Эксперименты с прерванной транскрипцией , . . . . 94

3.2. Ограничения...........· ¦ ^°

3.3. Анализ с помощью гибридизации и расщепления нуклеазой S1 99

4. Оптимизация транскрипционной активности РНК-полимеразы II 101

4.1. Подбор концентраций ДНК и экстракта...... J"»

4.2. Различия между экстрактами......... ||™

4.3. Условия реакции............ 104

5. Посттранскрипционный процессинг молекул — предшественников

мРНК................ ^

О.1. Кэпирование и метилирование......... J^o

5.2. Сплайсинг..............

5.3. Полиаденилирование..........¦ '?5

6. Транскрипция в бесклеточных экстрактах при участии РНК-полимераз I и III.............. °°

Благодарности.............. ш«

Литература............... 1и9

Глава 4. Транскрипция РНК в изолированных ядрах. У. Марзлаф и

р. Хуан............... 111

1. Введение...............

2. Выделение ядер.............. }}~

2.1. Введение.............. {{-

2.2 Основной метод............. ??°

2.3. Меры защиты от нуклеаз и протеаз....... j

2.4. Варианты метода выделения ядер....... 117

2.5. Выделение хроматина с эндогенной РНК-полимеразной активностью .............. jjp

3. Синтез РНК в изолированных ядрах........ 119

3.1. Условия синтеза РНК........... Л.

3.2. Определение активности различных РНК-полимераз . . jfl

3.3. Выделение РНК............ }~

4. Общий анализ синтеза РНК..........

4.1. Анализ суммарных РНК-продуктов....... J«

4.2. Скорость элонгации........... |??

4.3. Инициация синтеза РНК.......... \JS.

5. Анализ специфических РНК-транскриптов ...···

5.1. Очистка РНК-транскриптов......... 1аь

396

Оглавление

5.2. Количественная оценка специфических РНК-транскриптов . 138

5.3. Определение размеров специфических РНК-транскриптов 142

5.4. Определение концов РНК-транскриптов...... 145

6. Применение систем ядерной транскрипции...... 147

6.1. Измерение относительной скорости транскрипции гена . . 147

6.2. Что такое первичный транскрипт........ 149

6.3. Выделение и изучение первичных транскриптов . . . , 150

6.4. Изучение посттранскрипционных модификаций .... 151

6.5. Изучение ядерного транспорта зрелой РНК..... 156

6.6. Изучение регуляторных факторов........ 157

Благодарности.............. 157

Литература...............157

Глава 5. Транскрипция хроматина. С. Гилмор....... 160

1. Введение............... 160

2. Выделение хроматина............ 160

3. Источник РНК-полимеразы........... 161

4. Оптимальные условия транскрипции in vitro...... 165

4.1. Проблемы, связанные с эндогенной РНК..... 165

4.2. ДНК-зависимая транскрипция хроматина..... 167

5. Анализ РНК-транскриптов........... 169

5.1. Гибридизация со специфическими ДНК-зондами ... 169

5.2. Картирование сайтов инициации транскрипции с помощью нуклеазы S1............. 173

6. Обоснованность применения РНК-полимеразы Е. coli ... 180

7. Фракционирование и реконструкция хроматина..... 181

7.1. Фракционирование хроматина......... 181

7.2. Реконструкция хроматина.......... 182

7.3. Точность реконструкции.......... 183

Литература.............., 184

Глава 6. Прокариотические системы экспрессии генов in vivo. ?. Стоике ?, Дж. Пратт, Б. Холланд........*. 186

1. Введение...............186

2. Система клеток-хозяев, облученных УФ-светом..... 190

2.1. Введение..............190

2.2. Материалы и штаммы........... 192

2.3. Штамм бактерий-хозяев.......... 192

2.4. Получение фага............ 194

2.5. Методика введения метки в кодируемые фагом белки . . 195

2.6. Возможные проблемы........... 197

2.7. Использование нелизогенного хозяина...... 198

2.8. Использование фагов с другими областями иммунности 198

3. Система мини-клеток............ 199

3.1. Введение.............. 199

3.2. Материалы и штаммы........... 200

3.3. Штамм Escherichia coli DS410 — продуцент мини-клеток . 200

3.4. Подходящие плазмиды.......... 200

3.5. Получение мини-клеток.......... 201

3.6. Мечение белков, кодируемых плазмидой..... 205

3.7. Возможные проблемы........... 206

3.8. Фракционирование мини-клеток........ 207

3.9. Появление полипептидов-предшественников..... 207

ЗЛО. Заражение мини-клеток бактериофагами..... 208

4. Система макси-клеток............ 208

Оглавление

397

4.1. Введение.............. 208

4.2. Выбор штамма бактерий для получения макси-клеток . . 208

4.3. Подходящие плазмиды.......... 210

4.4. Получение макси-клеток.......... 210

4.5. Возможные проблемы........... 212

5. Соответствие между генами и их продуктами . . . 213

Благодарности.............. 214

Литература............... 214

Глава 7. Сопряженные прокариотические бесклеточные системы транскрипции— трансляции. Дж. Пратт........ 216

1. Введение............... 216

2. Получение бесклеточной системы Зьюби....... 216

2.1. Введение............... 216·

2.2. Оборудование и реактивы.......... 217

2.3. Получение клеток............ 218

2.4. Получение 530-экстракта .......... 221

2.5. Оптимизация системы........... 223

3. Получение бесклеточной системы Голда и Швейгера . . . 230

3.1. Введение.............. 230

3.2. Оборудование и реактивы.......... 230

3.3. Получение клеток............ 230

3.4. Получение бесклеточного экстракта....... 232

3.5. Оптимизация системы........... 233

3.6. Модификация основной методики........ 234

4. Использование в качестве матриц ДНК плазмид или фага ? 234

4.1. Экспериментальные подходы......... 234

4.2. Идентификация продуктов клонированных генов . . . 234

4.3. Идентификация предшественников белков..... 237

4.4. Исследования регуляции экспрессии генов..... 240

5. Использование линейных ДНК в качестве матриц .... 241

5.1. Экспериментальный подход......... 241

5.2. Значение сверхспирилизации......... 244

5.3. Идентификация химерных белков ....... 245

5.4. Идентификация продуктов клонированных генов, сходных

по размеру с белками, кодируемыми вектором .... /4t>

5.5. Идентификация генов, клонированных со своими собствен-ными промоторами ............

5.6. Идентификация сайтов рестрикции внутри генов и между генами............... 94С.

5.7. Анализ ДНК в гетерологичных системах...... f*a

5.8. Экспрессия эукариотических генов....... j™*

6. Сравнение систем транскрипции — трансляции in vitro . . . jg*

6.1. Достоинства и недостатки модифицированной системы Зьюби ^Ji>

6.2. Достоинства и недостатки системы Голда и Швейгера . . 250

7. Преимущества системы in vitro по сравнению с системами in vivo 25|

8. Возможные проблемы при использовании систем in vitro . . 2bl

Благодарности.