а также множество экспериментальных данных свидетельствуют, что в ходе матричного биосинтеза происходит направленное перемещение матрицы относительно активного центра полимеразы нуклеиновых кислот или рибосомы. В этом смысле процесс считывания информации с молекул ДНК и мРНК скорее напоминает не снятие отпечатков с типографских матриц, а работу магнитофонной ленты, протягиваемой через считывающее устройство. Поэтому и говорилось, что термин матричный биосинтез и само понятие матрицы являются не вполне удачными.

Здесь сделана попытка сформулировать общие принципы матричного биосинтеза, свойственные всем системам, осуществляющим биосинтез белков и нуклеи-

17Й

новых кислот. Ниже рассмотрены конкретные биохимические превращения для трех главных матричных процессов и некоторые специфические особенности, присущие каждому из них.

5.4. БИОСИНТЕЗ ДНК (РЕПЛИКАЦИЯ)

Матричный синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами, выполняет две основные функции: репликацию ДНК, т.е. синтез новых дочерних цепей, комплементарных исходным материнским цепям, и репарацию двунитевых ДНК, имеющих бреши в одной из цепей,образовавшиеся в результате вырезания поврежденных участков этой цепи специальными нуклеазами. В обоих случаях ДНК-полимеразы катализируют перенос дезоксирибонуклеотидных фрагментов от дезоксирибонуклеозид-5 '^грифосфатов на гидроксигруппу 3 '-концевого фрагмента растущей или подлежащей регенерации цепи. Уравнение реакции с использованием сокращенной символики (см. § 2.3) можно записать в виде

...pdX?_, pdX -ОН + pppdXi + 1-OH — ...pdX?.,pdX? PdX?+-OH + PP? №2)

Из этого уравнения видно, что ДНК-полимеразы являются представителями класса трансфераз.

Более полная запись должна учитывать обязательное присутствие комплементарной матрицы. Обозначая произвольную пару комплементарных дезоксирибо-

нуклеозидов как dX/lXj, уравнение ДНК-полимеразной реакции с участием матрицы можно записать в виде

(54 ••¦PdXi_, pdXi-OH (3') ..? _??

. . + ?????; + ?—OH -—

(3) ¦¦•¦dXi.IpdXi pdXitlpdX?+2p . . . (5' )

_^ (5')---pdX1.,pdX? PdX?4l-OH--. (3'1 {7Z)

(3')· ¦ --dXi., pdX; pdXitlpdXitlP. · -(5?

Использование в качестве субстратов дезоксирибонуклеозид-5 '-трифосфатов делает процесс образования фосфодиэфирных связей термодинамически выгодным, поскольку неблагоприятное в водном растворе образование фосфодиэфира из монофосфата и гидроксикомпонента (AG > 0) протекает сопряженно с гидролизом ангидридной пирофосфатной связи. Необходимая энергия запасается на предыдущих нематричных стадиях фосфорилирования дезоксирибонуклеозидмо-нофосфатов, происходящего с участием соответствующих нуклеозидмонофосфат-и нуклеозиддифосфаткиназ (см. § 4.2). На этих стадиях расходуется АТФ, т. е. потребляется энергия, запасенная в пирофосфатных связях этого универсального аккумулятора энергии в биологических системах.

Как видно из уравнения (V.3), в реакции помимо фермента участвует три компонента: матрица, растущая цепь и субстрат. Наличие в системе фрагмента нуклеиновой кислоты, комплементарного матрице, является необходимым условием функционирования ДНК-полимераз. Этот фрагмент называют затравкой по аналогии с затравочным кристаллом, вносимым в насыщенный раствор при кристаллизации, или, чаще праймером (русифицированный вариант английского термина primer).

В клетках как прокариот, так и эукариот имеется несколько различных Дпл-

177

полимераз. В частности, для E.coli известно три ДНК-полимеразы: I, Ц и III. Функции ДНК-полимеразы Ц мало изучены, и она не является жизненно необходимым ферментом — мутанты с дефектной ДНК-полимера-зой II жизнеспособны и могут размножаться. ДНК-полимераза I является первым открытым матричным ферментом (А.Корнберг, 1956) и к настояще-,му времени изучена наиболее полно. Она представляет собой белок, построенный из одной полипептидной цепи, имеет молекулярную массу свыше 100 кДа и является ферментом репарации. По-видимому, она участвует также в некоторых заключительных стадиях репликации. ДНК-полимераза III состоит из семи субъединиц, в сумме составляющих около 380 кДа, причем собственно ДНК-полимеразной активностью обладает ее самая большая субъединица с молекулярной массой около 140 кДа. Она является ферментом репликации. Если ДНК-полимеразы I в клетке присутствует несколько сотен копий, то реплицирующей ДНК-полимеразы III содержится 10 - 20 копий. В то же время в реакции элонгации она работает со скоростью, превышающей в 15 раз скорость работы ДНК-полимеразы I.

У эукариот достоверно установлено наличие не менее трех ДНК-полимераз. В репликации ДНК хромосом участвует ДНК-полимераза а, в репарации - скорее всего ДНК-полимераза ?, ДНК-полимераза f является ферментом, осуществляющим репликацию ДНК митохондрий.

Репликация двунитевой ДНК в клетках является сложным, далеко не во всех деталях исследованным процессом. Реакция (V.3) является не единственным химическим событием, происходящим в ходе репликации. Ниже рассмотрены другие наиболее достоверно установленные и имеющие общее значение химические превращения, необходимые для полного удвоения материнских молекул ДНК.

Репликация не начинается, как правило, с концов линейных двунитевых молекул. Это тем более верно для кольцевых молекул, у которых такие концы просто отсутствуют. В классическом варианте репликация начинается в строго определенных участках, получивших название участков ori (сокращение от термина origin of replication), и от этого участка распространяется в обе стороны-Поскольку двунитевые ДНК хорошо видны под электронным микроскопом, т° возможно визуальное наблюдение процессов как для линейной ДНК (рис. 50) н» примере ДНК бактериофага Т7, так и для кольцевой ДНК (рис. 51) на пример6 плазмидной ДНК и вирусной ДНК Обезьяньего вируса 40 (SV40). В случае линей'

on

т.. - . ^

—Xt/""

©

©

_I_fa ^fflmillli,1,.......,...........¦.........«?— —,?.?.?. ,?, и. —TTi. ..f. ? п.. in ? п.,. ггт ???.-?? ??- г ? -и- ? ? - ? и -injlj-l,..!!, .*** ?

4-4~?— ? -¦ ¦¦......¦ "?· . ........'У)

?

¦ Рис. 50. Схема репликации линейной двунитевой ДНК:

J - исходная двунитевая ДНК; 2-S - промежуточные структуры до достижения вилкой репликации левого конца ДНК; 4 - промежуточная ?-образная форма; 5 - разошедшиеся новые двунитевые структуры. Жирной чертой изображены материнские цепи, тонкой - дочерние; стрелки обозначают направление вдоль цепи от 5 '- к 3 -концу

Рис. 51. Схема, репликации кольцевой двунитевой ДНК. (обозначения те же, что на рис. 50):

/ - исходная кольцевая ДНК; 2 - начальная фаза репликации: ? - средняя фаза репликации: 4 - структура незадолго до конца репликации и расхождения новых двунитевых структур

ной ДНК первоначально образуется фигура, имеющая форму глаза. Затем, когда репликация одной из нитей достигнет конца молекулы, структура принимает ?-образную форму. При репликации кольцевой двунитевой ДНК промежуточная структура называется ^-образной в соответствии с тем, как она выглядит в середине цикла репликации. В обоих случаях в обе стороны от участка ori перемещаются области, в которых непосредственно проходит репликация и которым предшествуют точки разветвления материнских цепей ДНК. Участок, примыкающий к точке разветвления, называют репликационной вилкой. Ниже рассматриваются процессы, происходящие в вилке репликации, перемещающейся влево от наблюдателя. События, предшествующие началу репликации в участке ori, сложны и до конца не изучены, поэтому они рассматриваться в этом курсе не будут.

Для того чтобы новые участки материнских нитей становились доступными репликации, должно происходить разделение нитей. Это достигается с помощью специальных ферментов — геликаз, которые перемещаются в рассматриваемом случае влево вдоль обеих цепей материнской ДНК, раскручивая их. Такое направленное перемещение ферментов требует затраты энергии, и каждый акт перемещения обеих геликаз сопровождается гидролизом пирофосфатной связи в молекулах АТФ. Таким образом, геликазы обладают АТФазной активностью. Геликазы неидентичны, поскольку им приходится двигаться в различных физических направлениях двух полинуклеотидных цепей. В ходе продвижения вилки репликации в определенном направлении, в рассматриваемом случае влево, вилка, а следовательно, и геликазы, в силу антипараллельной ориентации комплементарных материнских цепей, по отношению к одной из них движутся от 3'- к 5 '-концу, а по отношению к другой от 5'- к 3 '-концу. В случае E.coli первая получила название геликазы а или Rep-белка, вторая — геликазы II.

В отличие от геликаз ДНК-полимеразы в соответствии с приведенной схемой (V 3) катализируемой ими реакции могут перемещаться только от 3'- к 5 '-концу Матрицы. Поэтому непрерывное продолжение элонгации растущей цепи по мере Раскручивания двунитевой материнской ДНК может идти только вдоль одной Цепи-матрицы, той, относительно которой вилка репликации движется от 3'- к

- концу. Непрерывно синтезируемая цепь получила название ведущей (рис. 52). Чтобы начался синтез на второй материнской цепи-матрице, необходима инициация синтеза новой цепи. Эта цепь получила название запаздывающей. Однако,

J-

"V__:

1:

a —

?????^??

I

?

I1

®

б

Рис.

*............

0

ДА'

52. Схема процессов, происходящих по мере продвижения вилки репликации влево: а — геликаэа II; б — геликаэа а (Rep-белок); ? — ведущая дочерняя цепь ДНК; ?, ?', ? - рибонуклеотидные прайме-ры; д, д , дд - запаздывающая дочерняя цепь; / - образование праймера на матрице запаздывающей цепи; 2 - синтез запаздывающей цепи; 3 - образование нового праймера; 4 ~ синтез нового фрагмента запаздывающей цепи до стыковки с предыдущим фрагментом; 5 - удаление первого рибонук-леотидного праймера и застройка бреши дезоксирибонуклео-тидным фрагментом; 6 - соединение двух фрагментов запаздывающей цепи ДНК-лигазой и образование следующего праймера. По ходу всех процессов 1-6 идет элонгация ведущей дочерней цепи

как уже указывалось, для ДНК-полимеразы необходимо наличие связанного \ матрицей праймера. Такой праймер создается с помощью специального