е выступать в роли электрофиль-ных катализаторов, отсутствуют. Ион цинка фиксирован в активном центре фермента путем координации тремя аминокислотными остатками — двумя остатками гистидина His-69 и llis-196 и одним глутамат-ионом Glu-72. Четвертая координата (для ионов цинка характерна тетраэдрическая sp3-KOH фигурация координационных связей) направлена в комплексе фермент — ^субстрат на карбонильную группу гидролизуемой пептидной связи. Фиксация С-концевой части гидролизу-емого пептида в активном центре обеспечивается в первую очередь взаимодействием с двумя остатками аргинина — Arg-145 и Arg-127 и кластером гидрофобных

аминокислотных остатков — Туг-198, Туг-248 и Пе-247. Положительно заряженные остатки аргинина взаимодействуют с С-концевой карбоксильной группой. Это взаимодействие является главным фактором, обеспечивающим селективность карбоксипептидазы именно к С-концевым аминокислотам. Гидрофобные компоненты активного центра обеспечивают преимущественную фиксацию в нем гидрофобных С-концевых остатков. Уже из этого рассмотрения становится ясной абсолютная стереоспецифичность фермента — при аналогичной посадке D-амино-кислотного остатка в сторону каталитического центра — координированного иона Zn* — будет направлен атом ? при хиральном атоме С. Дополнительно стереоспецифичность обеспечивается формой полости, в которой происходит фиксация субстрата. Внутренняя поверхность полости в направлении связанного с хираль-ным центром С-концевой аминокислоты атома ? достаточно близка к нему и не допускает замены его на какой-либо превышающий его по размеру фрагмент без существенной деформации полости. Поэтому даже связывание С-концевого фрагмента в D-конфигурации затруднено.

В случае карбоксипептидазы А аминокислотные остатки апофермента, как и в случае рибонуклеазы, обеспечивают отбор и нужную ориентацию субстрата относительно активного центра. Кроме того, специальные остатки аминокислот участвуют в связывании кофактора — иона цинка.

В белках отсутствуют какие-либо группы, способные участвовать в окислительно-восстановительном катализе. В тех случаях, когда такой катализ необходим для осуществления окислительно-восстановительного превращения, в качестве кофакторов используются ионы металлов переменной валентности или специальные органические молекулы, такие как гем (1) и флавиновые коферменты (68 а, б и 69).

Во всех случаях, как это видно на примере карбоксипептидазы ?, белок организует работу кофактора наиболее эффективным образом. Более того, в зависимости от структуры белка может усиливаться одна из присущих кофактору нескольких функций, в результате чего в разных комплексах один и тот же кофактор играет существенно разную роль. Например, гем в комплексе с глобином в незначительной мере проявляет свою склонность к окислительно-восстановительным превращениям и функционирует в основном как комплекс, координирующий молекулу Ог- В каталазе в комплексе с соответствующим апоферментом он проявляет способность катализировать двухэлектронное окисление — восстановление НгОг- В цитохроме с тот же гем выполняет функцию одноэлектронного переносчика, меняя в каждом акте переноса электрона состояние иона железа от Fe(II) к Fe(III) и обратно.

Таким образом, из приведенных примеров следует, что белок в роли фермента или апофермента принимает участие в выполнении четырех главных функций. Во-первых, белок обеспечивает специфичное опознавание субстратов, приводящее к образованию комплекса, в котором реагирующие части этих субстратов необходимым образом ориентированы относительно каталитического центра. Во-вторых, он принимает участие в каталитическом акте своими кислыми и основными группами по механизму общего кислотно-основного катализа. В-третьих, в ряде случаев ковалентно связывает часть молекулы субстрата с образованием промежуточного продукта, выступая в этом случае в качестве нуклеофильного катализатора. В-четвертых, в качестве апофермента белок обеспечивает связывание в активном центре иона или молекулы кофактора.

207

Этим функции белка как фермента или апофермента скорее «сего не исчерпываются. Все рассмотренные механизмы предполагали достаточно статичное расположение функциональных групп белка в активном центре. Это не совсем верно. Взаимодействие с субстратом нередко сопровождается изменением конформации белковой молекулы, и согласно теории, выдвинутой Кошландом, направленные конформационные изменения белка являются важным фактором ферментативного превращения. В отдельных случаях такие изменения зарегистрированы с помощью реитгеноструктурного анализа. Например, карбоксипептндаза А была подвергнута рентгеноструктурному анализу как в отсутствие субстрата, так и в комплексе с глицил-Ь-тирозином. Полость, в которой находится активный центр, существенно сужается при связывании этого субстрата, т.е. наблюдается отчетливый конформационный переход. Кроме того, широко дискутируется и имеет в отдельных случаях убедительные подтверждения гипотеза, согласно которой фермент фиксирует субстрат в конформации, существенно более близкой по своей геометрии к активированному комплексу реакции, чем коиформацня субстрата, преобладающая у несвязанных молекул. Это, естественно, должно приводить к снижению активацнонного барьера реакции и способствовать существенному ускорению превращения.

Изучение механизма действия ферментов как с целью выявления общих принципов ферментативного катализа, так и для установления деталей механизмов отдельных конкретных ферментативных реакций остается одной из центральных задач теоретической биохимии. Наряду с огромным мировоззренческим значением эта задача приобретает большую практическую значимость, поскольку открывает перспективу сознательного конструирования более совершенных молекул ферментов и апоферментов. Спроектированные молекулы могут быть затем получены путем химического синтеза соответствующих поли пептидов или методами генетической и белковой инженерии, которые вкратце рассматриваются в §7.11.

6.2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ

РЕАКЦИЙ

Ферментативное превращение происходит в комплексе фермент — субстрат и может в достаточно хорошем приближении рассматриваться как мопомолекуляр-ное превращение этого комплекса. Это превращение может в терминах § З.Ю рассматриваться как ответ системы на образование комплекса, и для описания можно воспользоваться приведенными н этом параграфе соотношениями. В энзимологин по традиции принято использовать несколько другие обозначения Фермент (энзим) обозначают буквой Е, а специфический лиганд, субстрат ферментативного превращения, — буквой S. Кроме того, обычно для характеристики комплексообразоваппя используют не константу ассоциации, а константу диссоциации комплекса Ks. С учетом этих обозначений для типичного случая, когда полная концентрация субстрата s намного превосходит полную концентрацию фермента [?], выражение для концентрации комплекса фермент — субстрат на основании уравнения (З.б) запишется в виде

[ES] = rrfe' <«·'>

а выражение для скорости ? ферментативной реакции — в виде

1 + (Ks/s) · У°г)

где &кат — константа скорости превращения комплекса фермент — субстрат в продукт реакции с регенерацией свободного фермента.

Более строгое рассмотрение должно учитывать, что соотношение между свободными ферментом и субстратом и их комплексом не является равновесным. Комплекс ES не только диссоциирует, но и претерпевает превращение в свободный фермент и продукт реакции. Поэтому следует говорить не о термодинамически равновесной концентрации комплекса, а о его квазистационарной концентрации, которая устанавливается вскоре после начала превращения в результате выравнивания скоростей образования и расходования комплекса по обоим путям. Для этого нужно записать схему процесса в несколько усложненном виде:

? + S 5==^ ES

к-?

i ES

(6.3)

ES ? + ?

Здесь ? — продукт реакции.

Условие квазнстацпопарности при этом записывается в виде

*i[E][S] = *-i[ES] + fcK«[ES] (6.4)

или с учетом того, что

[Е] + [ES] = [E]fc

в виде

t,[E],[S] = (?·., + *кат + MS])[ES]

и, следовательно, концентрация комплекса после установления квазистационарио-го режима будет равна

ГРЧ1 - MEMS] _ [E]t

1 J ." *-1 + *кат + *,[SJ ~ ! + к. , + к

Т7Щ

кат

а скорость ферментативного превращения

1 +

= А'иат[Е] f- (б 5)

"¦'-1 + "-"кат

MS]

Это выражение при концентрации субстрата, существенно превышающей концентрацию фермента, по характеру зависимости скорости от концентрации субстрата S идентично (6.2), однако вместо константы диссоциации комплекса стоит несколько более сложная величина

209

(6.6)

называемая константой Михаэлиса. Сравнение с (б.4) показывает, что эта константа характеризует соотношение между концентрациями Е, S и ES в условиях квазистационарности

- [?] [s;

(6.7)

Из (6.5) следует, что по мере увеличения концентрации субстрата при неизменной концентрации фермента скорость стремится к предельному значению, которое в энзимологии принято называть максимальной скоростью:

Vmax — ^кат [?] ? · С учетом этого выражение (6.5) можно записать в виде

V —

— П1ах

(6.8)

(6.9)

1 + Л'м/s '

В такой форме оно известно в биохимии как уравнение Михаэлиса — Менте». Так как задаваемая им зависимость ? от s по характеру идентична зависимости ответа системы от концентрации специфического лиганда, то уравнение Михаэлиса может быть представлено в виде линейных анаморфоз, аналогичных (3.13) и (3.14), которые в обозначениях, принятых в энзимологии, имеют вид

· +

А'м/Ит

'max

(6.10)

(6.11)

Для иллюстрации на рис. 63 приведена в координатах ?/? — 1/s зависимость скорости гидролиза карбобензилокспглицилфенилаланина, катализируемого карбоксипептидазой А, от концентрации субстрата. На рис. 64 в координатах

40 ю ?/?, (моп»/яг'

Рис. 63. -Зависимость скорости гидролиза кнрбобензилоксиглицилфенилаланина под действием карбоксипептидазы от концентрации субстрата в координатах l/? - 1/л (по данным Кауфмана и Нейрита)

6 ю (????1,

Рис. 64. Зависимость скорости гидролиза аденозинтрифосфата, катализируемого миоз