рованного полипептидного синтеза. Так, уже упоминавшийся синтез протеазы ВИЧ-1 провели на автоматическом in птилиом синтезаторе и потребовалось около двух-??· 291

сн, о сн, о _ о

HjC-c-O-C-NH-CH-C-O-^^Jb-CHj-C-NH-CHj-^^Kg)

сн, -

1Ч{угоксикарбонил-Р>1в-0-феиилац«тамидом«тильная смола

Снятие Вос-аащитной фуппы I CF,COOH /СН,С1,

СН. о

¦ ? 4 и

H-N-CH-C-0-

-<^>-CHa-C-NH-CH,-нейтрализация! (H,C),-CH-N-CH—(СН,),. DMF I С,Н,

СН, о

? * и

?,?-CH-C-O-

-(^-CH2-C-NH-CH,-(^? СН, О О

конденсация I H,C-c-o-C-NH-CH-C-OH ¦

V N

™» дцк ««? ^^^V

сн, о о сн, о

u. I 1 и I и

HjC-c-O-C-NH—СН—С—NH-CH-C—О-

сн, сн,

~^>-сн2 -с-нн-снг^К?)

о*с~ - \w/

— ? Н,С—С Использование уксусного кэпирование Л ангидрида для блокирования

ш и с_С

' з чч непрореагировавших а-аминофупп первый цикл 0

^Следующие циклы активации с ВОС защищенными аминокислотами

Снятие синтезированного пептида . HS_R /н0_/^\ с носителя, очистка и выделение ', у-—/

продукт. * H,CCOOH/H,0

Pro-Oln-Ile-Thr-Leu-Trp-Oln-Axg-Pro-Leu-Val-Thr-Ile-Lye-Ile1' Gly-Gly-Qln-Leu-Lye-Glu-Ala-Leu-Leu-Aep-Thr-Qly-AlB-???-???'30 Thr-Vel-Leu-Glu-Glu-ltet-Ser-Leu-Pro-Gly-Axg-Trp-Lye-Pro-Lye4* aly-aly-Ile-Oly-Oly-Phe-Ile-Lye-Vel-Xrg-aln-Tyr-Aep60 aln-Il«-L«u-Ile-alu-Il«-CyB-01y-HiB-Lya-Ala-Il«-ely-Thr-VBl75 Leu-Val-Gly-Pro-Thr-Pro-Val-Aen-Ile-Ile-Gly-Arg-Aen-Leu-Leu90 Thr-Gln-Ile-aiy-Cye-Thr-L«u-A«n-Ph»99

Рис. 81. Схема твердофазного метода синтеза по Меррифилду 99-членного пептида, предста юшего собой протеазу, кодированную вирусом ВИЧ-1, вызывающим СПИД

сот химических процедур, не считая промывЪк предшествующих каждой смене реагента. На завершающей стадии защищенной пептид, ковалентно связанный со смолой, снимается с нее и защитные группы уДаляютСя соответствующими обработками (рис. 81).

Одной из тяжелых проблем, возникающих при полипептидном синтезе, является рацемизация аминокислот во время син^за Активация аминокислот вызывает частичное превращение их в так называете азлактоНы (ПОа), например по реакции с ДЦК из интермедиата (102):

¦V Z-C=N-CHR + ДЦМ I I

о—с=о

110а

Азлактон является активированной формой <:0ответствующей ациламинокислоты и может также участвовать в полипептидном синхезе. Однако он может частично таутомеризоваться в (1106):

Z—C=N—CHR Z--C=N_CR

II I II

0-С=0 0-c-flH

1106

Обратное превращение таутомера (1106) в азлакхон происходит нестереоселектив-но и приводит к рацемизации аминокислотное остатка. Это особенно опасно при твердофазном синтезе, так как в этом случ^е не используются промежуточные стадии очистки и происходит постоянное накопление диастереомеров в растущей полипептидной цепи. Не существует способов позволяющих целиком избежать рацемизации. Однако ряд активирующих п00цедур позволяет снизить степень рацемизации. Наилучшие результаты достига^^ использованием ДЦК в смеси с нуклеофильным катализатором, например ги.Цр0ксибензотриазолом в этом слу_ чае ?-ацетиламинокислота (чаще всего Вос-а^инокислота) превращается in situ в активированный эфир, который существенн0 меныпе склонен к образованию азлактон а.

7.10. ХИМИЧЕСКИЙ СИНХЕЗ ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИдов

Термодинамические и кинетические проблемы, возникающие при химическом синтезе нуклеиновых кислот, не отличаются от уже рассмотренных при пептидном синтезе. Соединение остатка фосфорной КИСЛОТы с 0Н-группой соседнего нуклеотида неблагоприятно ни термодинами^ески (процесс сопровождается увеличением свободной энергии системы), ни ьинетически, поскольку необходимо взаимодействие двух нуклеофильных остатьов jja первом этапе становления химического синтеза олиго-, а затем и полин^ео^дов развитие пошло по тому же пути, который был использован и в пептиДном синтезе, а именно по пути

N-C6Hn II

Z-C-NHCHRC-0-C

II II I

0 0 ??-СбНц

превращения фосфатных остатков в электрофильные производные с одновреме ным обеспечением их избыточной свободной энергией за счет сопряженного экзэргонического процесса. Так же как и при пептидном синтезе, для получения упорядоченных олигомеров необходимо использовать защитные группы, чтобы на каждом акте конденсации соединять между собой строго определенные фосфо-рильную и ОН-группу, не давая развиться неупорядоченному процессу статистической поликонденсации. Наличие у трех нуклеотидов экзоцнклических аминогрупп потребовало введения защит по этим группам, достаточно устойчивых, чтобы сохранять их на протяжении всего синтеза, и в то же время удаляемых по завершении синтеза без повреждения образовавшихся межнуклеотидных связей.

Первый синтез функционального гена был осуществлен Гобиндом Корана с сотр. Синтез состоял из трех основных стадий: получения защищенных мономеров, конденсации их в олнгонуклеотнды достаточной длины и объединения их в двуцепочечную ДНК с использованием ДНК-лигазы, описанной в § 5.4. Поскольку метод включает ферментативную стадию, его называют химико-ферментативным синтезом. Первый подход к образованию межнуклеотидных связей основывался непосредственно на образовании фосфодиэфирной связи и получил название фосфодиэфирною метода синтеза. Фосфатный остаток одного компонента (Р-компонент) активировали путем превращения в электрофильное фосфорилиру-ющее производное и использовали его для этерпфикацпп ОП-группы второго компонента (ОН-компонент). Наилучшие результаты были достигнуты при применении триизопропилбензосульфонил хлорида, который, как было показано, в растворе пиридина дает высокореакционноспособное фосфорилпиридиниевое производное Р-компонента (111):

0 О

II II R0-P-0- + (г - Pr)3Cr,HoS0>Cl [UQ-P-OSU,С61Ь( t - Pr)3] -»

1 " ' I

о- о-

то

+пириди

^ RQ-P-N<^©^> + (* - Pr)3CelbSQ; + CI- (VII.23)

О" 111

Это производное легко реагирует с гидроксигруппой ???-компонента: О О

R0-P-N<^©^> + 1I0R' -» RQ-P-0R' + 11N'<^©^> (VI1.24)

О" 0"

где R, R — нуклеозидные или нуклеотндные фрагменты. Для того чтобы защитить аминогруппу аденина, цитозина и гуанина, соответствующие нуклеозиды или нуклеотиды предварительно превращали в ?-бензоил, ?-анпзоил или ?-бу-тирильное производное. Эти защитные группировки до сих пор остаются наиболее популярными в современных методах конденсации. Тем не менее прямое образование фосфодиэфириых связей оказалось малоэффективным из-за ряда 294

побочных реакций, приводящих к ощутимому снижению скорости реакции и выходам, далеким от количественных.

Фосфоэфирная конденсация была существенно улучшена путем введения синтонов, которые в совокупности с достаточно стабильными защитными группировками фосфатной группы (главным образом 4-хлорфенил) приводили к образованию межнуклеотидных фосфатных фрагментов, защищенных арильным остатком. Этот метод до сих пор используется и называется фосфотриэфирным методом олиюнуклеотидною синтеза. Хорошие скорости конденсации были достигнуты при использовании в качестве конденсирующего реагента (/-Рг)з CeHaSOjCl в присутствии нуклеофильного катализатора, например ?-метил-имидазолида. Основные стадии фосфотриэфирной конденсации могут быть представлены в следующем виде:

0

N

R0—P—0" + ArS02Cl + | ОАг

.СН3

R0-P-

СНя

+ ArS03H + НС1

ОАг 112

О СНз (112) + H0R' -+ R0—?—OR' + ж I (VII.25)

<=1

ОАг

Однако в настоящее время синтез олигонуклеотидов в основном перешел на методы, основанные на фосфитной химии. Наиболее популярным из них является использование в качестве синтонов фосфитамидов (фосфорамидитов) (фосфит-амидный метод синтеза). Синтоны, используемые в этом методе, имеют строение

DinTr-0—? / 0 ^ Htr

0—P(0X)N(i-C3H7)2

где DMTr — 5 '-бис-(я-диметоксифенил)фенилметил (диметокситритил), Htr — М(6)-бензоиладенин, М(4)-бензоилцитозин или г!(2)-г-бутирилгуанин;

X = СН3 или СИ2СН2С^

Образование связи между Р- и ОН-компонентами в фосфитамидном методе происходит за несколько минут по сравнению с несколькими часами при фосфотриэфирной или несколькими днями при фосфодиэфирной конденсации. Фосфит-триэфирный фрагмент далее окисляется раствором 12. Таким образом, основные стадии конденсации можно представить в следующем виде:

ЛАЕ

dmtNuc'p — CO(CH2)3COOH + NH2(CH2)3Si-

ArSOjCi, ? - метилимидазол dmtNuc'p —CO(CH2)3CO —NH(CH2)3Si

(Спейсер g^^^tg ] CF3COOH В CHjCLj

honuc;.,-----Nuc;— IZZZZ2-

1dmtNuc;-OP(OCH3)N(/so-C3H,)3 ?" (тетразол) в ацетонитриле

dmtNuc'(0 —?—ONucj.,-----Nuc,—ЩЩШ

OCH,

CF3COOH В CH2CI2

(CHjCO)ao (кэпирование) 4-диметаламилогшридин, ацетонитрил

dmtNuc',0 —? —ONuc].,-----Nuc',—

OCH,

О

•а/ в водном пиридине

dmlNuc,0—?—ONucJ^------Nuc', —m

OCH,

i.=n

J NH

в диоксане

3 (КОНЦ)

dmlNuc„0 —?—ONucn.,0-----Nuc,

Г.----Ъ~~'--------?

К II г s "^?

I NiicnО —? —ONuc-,0-¦·¦ — Nuc'^'i

I

.0-

R0-P(0X)-N(i-C3H7)2 + HOR' —* RO-P(OX)-OR' + NH(i-C3H7)2

0

II

RO-P(OX)-Ru ' + I2 + H20 -» RO-P-flR' + 2HI (VII.26)

I

OX

Метальные и цианэтильные, а также ацильные остатки, защищающие экзоцик-личные NH2-rpynnbi гетероциклов, удаляются по завершении сборки полной полинуклеотидной цепи.

Другой метод, основанный на фосфитной химии, обычно называют ff-фос-фонатным методом синтеза. В этом методе используются Н-фосфонатные синтоны

DinTr—? / Оч Htr

о—?—?-?

и

113

Н-фосфонаты активируют обработкой пивалоилхлоридом (СНз)зСС(0)О. Межнук-леозидные Н-фосфонатные связи достаточно стабильны и могут окисляться до фосфата по завершении образования полинуклеотидной цепи. Конденсация приводит к Н-фосфонат фосфодиэфиру согласно реакции

0 О

II II RO-P-0" + (CH3)3CC(0)C1t-R'0H-^R0-P-0R' + СГ Ш127)

1 I

? II Перед каждой стадией конденсации как в фосфитамидном, так и в Н-фосфонат-ном методе остаток DMTr удаляется с растущей полинуклеотидной цепи слабой кислотной обработкой, освобождая 5 '-ОН-группу для следующей стадии роста синтезируемой цепи.

Оба метода легко автоматизируются в твердофазном варианте аналогично методу, предложенному для пептидного синтеза Меррифилдом. Более того, фос-фитная химия вообще чрезвычайно редко применяется в жидкофазном варианте. В качес