талла биополимера.

Знание функции Fn0) позволяет по уравнению (7.10) рассчитать функцию р(г). Эту функцию можно наглядно представить в виде серии карт электронной плотности для различных параллельных срезов через элементарную ячейку, на которых изображены системы линий, соединяющих точки с одинаковой электронной плотностью наподобие горизонталей на топографических картах.

В качестве иллюстрации на рис. 91 изображен участок карты электронной плотности белка — цптохрома C5?,i (из микроорганизма Preudomonas aeraqinosa), содержащего пиррольные кольца тема. Отчетливо просматриваются максимум электронной плотности (сгущение линий), соответствующий атому Fe, и максимумы, соответствующие пиррольным кольцам. Следует отметить, что в большиист

Втцаспанмя ось

Рис. 90.Схема определения комплексного фактора рассеяния для кристалла биополимера из найденных экспериментально модулей факторов рассеяния кристаллов незамещенного |^п(3)| и изомо|>фно замещенного полимера

I^лм(З)I и комплексного фактора рассеяния FM(S) атомов

случаев отдельные атомы па таких картах не прорисовываются. Однако, поскольку геометрия фрагментов хорошо известна из данных по рентгепоструктуриому анализу низкомолекулярных соединений, детальное расположение отдельных атомов, как правило, удается вписать в полученное изображение макромолекулы.

Подавляющая часть рентгеноструктурных исследований биополимеров выполнена с использованием в качестве источников рентгеновского излучения монохроматического излучения рентгеновских трубок. В последние годы началось интенсивное использование синхронною излучения, возникающего в ускорителях элементарных частиц, где заряженные элементарные частицы (например электроны) движутся по круговой орбите со скоростью, близкой к скорости света, и становятся в соответствии с законами электродинамики источниками интенсивного электромагнитного излучения. Это излучение характеризуется сплошным спектром, из которого с помощью соответствующих монохроматоров можно вырезать излучение желаемой длины волны. Интенсивности синхротронного излучения, достигаемые в мощных ускорителях, существенно превышают величины, достижимые в рентгеновских трубках, что позволяет существенно ускорить сбор информации в рентгеновских дифрактометрах. Кроме того, возможность изменять длину волны и, в частности, проводить измерения так рассеяния вблизи края полосы поглощения рентгеновского излучения рассеивающих атомов позволяет по-новому более эффективно решать проблему фазовых множителей и обходиться без изоморфного замещения.

7.14. ДВУМЕРНАЯ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ БИОПОЛИМЕРОВ

Методом рентгеноструктурного анализа монокристаллов установлена детальная пространственная структура сотен белков, значительного числа олигонуклеотидов, нескольких транспортных рибонуклеиновых кислот. Однако встает вопрос, в какой мере установленная структура соответствует той, которая имеет место в функционально активном состоянии биополимера в растворе или в составе живого организма. Априорно нельзя ни исключить, пи оценить масштаб искажения структуры в результате формирования кристаллической решетки. Поэтому весьма существенно располагать независимой информацией о геометрии молекулы биополимера, пусть не столь полной, но зато соответствующей ее состоянию в растворе. Из экспериментальных методов наиболее прочные позиции завоевывают подходы, основанные на использовании ядерного магнитного резонанса, а первую очередь ядерного эффекта Оверхаузера.

Известно, что все ядра, имеющие спиновое квантовое число '/2, в постоянном Магнитном поле со значением магнитной индукции В могут находиться в двух независимых состояниях, соответствующих ориентации ядерных магнитных Моментов по направлению и против направления поля. Из яде)), входящих в состав биополимеров, такими являются ядра 'II, ''С и а1г\ Разность энергий, соответствующих двум состояниям, составляет glUi, где g — фактор Лапде — без-

Рис. 91. Участок караты ¦электронной плотности ци-тохрома ('',',[ из Pseiidoiuo-Uhs aeruginosa ь плоскости, содержащей гем

называемого аномального

размерная величина порядка от нескольких десятых долен единицы до нескольких единиц, имеющая характерное значение для каждого типа ядер (например, для протона д = = 5,584), /?N — константа,

называемая ядерным магнетоном и равная 5,05ЫСг27А-м2. Поэтому при облучении ядер, находящихся в магнитном поле, радиочастотным излучением с частотой и = — g0^B/h происходит резонансное поглощение энергии излучения, которое фиксируется как сигнал ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

В наиболее эффективных современных ЯМР-споктрометрах используются поля 10—15 Тл, что в случае протонов соответствует резонансным частотам 400—600 МГц. Так как сами ядра и электроны, составляющие молекулы исследуемого вещества, могут быть источниками локальных магнитных полей, то величина магнитной индукции в точке нахождения некоторого ядра, входящего в состав этих молекул, отличается от величины, создаваемой магнитом ЯМР-спек-

трометра, на малую, но доступную измерению величину ?? . Поэтому радиолой

излучение с частотой 7 поглощается не при индукции внешнего поля, равной Мдру, а при В = hvigp^ - ??

локУ-

Однотипные ядра, например протоны, в разных частях молекулы имеют разное магнитное окружение и резонируют при различающихся значениях В. Это дает возможность при высокой разрешающей силе ЯМ Р-спектрометра получить отдельные сигналы для каждой группы однотипно расположенных в молекуле ядер. В качестве примера на рис. 92 приведен фрагмент протонного (41) спектра ЯМР фермента рибонуклеазы в области, где резонируют протоны, связанные с атомами С2 и С4 имидазольных колец остатка гнстпдипа. Все четыре остатка гистидина, находящиеся в молекуле фермента в положениях 12, 48, 105 и 119, дают отдельные сигналы, отличающиеся на несколько миллионных долей (м.д) от магнитной индукции, создаваемой магнитом Я ? Р-спектрометра.

Условием стационарной регистрации сигнала ЯМР является наличие достаточно быстрой релаксации избыточной энергии, получаемой системой ядер, резонирующих при определенном значении индукции внешнего магнитного поля. Релаксация может происходить как путем передачи энергии па другие спиновые системы (спин-спиновая релаксация), так и па другие степени свободы (спин-решеточная релаксация). В противном случае за короткое время заселенность обоих энергетических уровней выравпяется, дальнейшее поглощение энергии прекратится и сигнал ЯМР регистрироваться не будет. Произойдет насыщение

41?

~-NH-CH-CO~

-» "? -7 -6 5,м.д.

Рис. 92. Фрагмент спектра ? ЯМР панкреатической рибонуклеазы:

HI и HI - сигналы от нтомоь ? при С2 и С4 имидазольного кольца His-105: Н2 и Н2 ' - то же. для His-ИЭ; НЗ и Нч ' - то же, для His-12; Н4 и Н4 ' - то же, для His-48

системы спинов радиочастотной энергией. В промежуточной области по мере приближения системы к насыщению будет наблюдаться уменьшение интенсивности сигнала.

Частичное или полное насыщение системы спинов г может происходить не только при наложении внешнего радиочастотного поля на резонансной частоте спинов г, но и при насыщающем облучении другой системы спинов j, простран-_ ственно сближенных с г в молекулах исследуемого соединения до расстояния не

более 5 X. Эти эффекты связаны с процессами переноса избыточной энергии от спинов j к спинам г по механизму диполь-дипольной кросс-релаксации. При этом чем меньше расстояние между ядрами г и j, тем выше скорость кросс-релаксации между ними, и, следовательно, тем эффективнее перенос энергии от спинов j к спинам г. Таким образом, если пара спинов г и j связана диполь-дипольным взаимодействием, то в условиях селективного насыщающего облучения на резонансной частоте ядер j происходит изменение равновесной заселенности энергетических уровней не только спинов j, по и спинов г, а значит, в ЯМР-спектре помимо полного подавления сигнала ядер j будет наблюдаться частичное изменение интенсивности сигнала ядер г. Такое изменение спектральной интенсивности сигнала ядер г в условиях насыщающего селективного облучения на резонансной частоте ядер j называют Ядерным эффектом Ооерхауэера (ЯЭО).

Величина ЯЭОу, наблюдаемая между спинами г и j в ЯМР-эксперименте, определяется значением скорости кросс-релаксации <7у между ними и длительностью времени облучения t:

???,?) = ?? (7.13)

В свою очередь, величина кросс-релаксации <Ту для пары спинов г и j представляется как функция времени корреляции г и расстояния п, между ядрами г

с J

И у.

-y*h2(r - 6т./1 + 4w0r2) =-27?0??-L - <7Л4)

где ? — магнитогирическое отношение для данного типа ядер; h — постоянная

Планка; ? — время корреляции межспинового вектора г —> j, u>o — частота с

спектрометра (rad/sec).

Если скорость вращения молекулы во внешнем магнитном поле велика (т.е.

время корреляции молекулы г короче, чем ?'?, где ?? — резонансная частота),

с "

то <7у положительна, что означает увеличение интенсивности сигнала г в условиях насыщающего облучения сигнала j (ЯЭОу > 0). Эта ситуация характерна Для маленьких молекул. В случае больших молекул, характеризующихся медленным вращением с временем корреляции г > w'Ql, Оу отрицательна, т.е. уменьшается интенсивность сигнала г в условиях насыщающего облучения сигнала j (ЯЭОу < 0).

В то же время видно, что <7у (а значит, и ЯЭОу) является резко убывающей Функцией расстояния между протонами i и ? {?? ¦» r'fi). Поэтому величина ЯЭО.

измеряемая в ЯМР-эксперименте при определенном времени облучения t, может! дать информацию о скорости кросс-релаксацми [см. уравнение (7.13)], а значит, и о расстоянии между определенными ядрами в молекуле [см. уравнение (7.14)]. Таким образом, определяя экспериментально ЯЭО для различных пар ядер исследуемой молекулы, можно получить количественную информацию о геометрии молекулы.

Спектры ЯМР биополимеров, содержащих большое число одинаковых ядер, представлены большим числом перекрывающихся сигналов, и отнести каждый сигнал к определенному атому и оцепить его интенсивность для измерения эффекта Оверхаузера является сложной, далеко не всегда выпо