Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

инового оранжевого от интенсивности возбуждающего света, адресуемого не красителю, а основаниям. Оказалось, что при увеличении интенсивности возбуждающего света интенсивность замедленной флуоресценции красителя возрастает параллельно с интенсивностью фосфоресценции оснований, отражающей концентрацию их триплетных состояний. По мере увеличения числа молекул красителя, приходящихся на полину-клеотид, сокращалось время жизни замедленной флуоресценции. Эти данные свидетельствуют о том, что энергия электронного возбуждения мигрирует сначала по триплетным уровням оснований до «столкновения» с ближайшим комплексом основание — краситель, а затем после триплет-синглетного переноса на краситель высвечивается в виде замедленной флуоресценции.

Чрезвычайно важно, что в ряде работ Галли обнаружена делокализация энергии возбуждения между основаниями ДНК при комнатной температуре, хотя вопрос о механизмах этой миграции энергии еще далеко не решен. Из данных Вайля и Галли следует, что флуоресценция красителей, комплексированных с ДНК, снабжается энергией, поглощаемой не одним, а 10— 20 или 25—30 основаниями.

«Откачка» энергии на краситель сопровождается одновременной защитой ДНК от фотоповреждений. Г. Б. Завильгельский с сотр. проследил влияние красителей акридинового ряда (атебрин, акридиновый оранжевый, профлавин) на фоточувствительность инфекционных ДНК к летальному действию ультрафиолетового света и показал, что максимальной защитной эффективностью обладает атебрин, ингибирующий около 96% летальных повреждений.

В связи с тем, что участие синглетного и триплетно-го возбужденных состояний в фотохимических реакциях полинуклеотидов определяется тремя факторами (природой основания, поглотившего квант света, типом фотохимического превращения и условиями, в которых оно протекает), мы будем обсуждать вопрос о роли синглетных и триплетных уровней для каждого конкретного случая в отдельности.

3. ТИПЫ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Прежде всего необходимо подчеркнуть, что пурино-вые основания приблизительно на порядок более фоторезистентны, чем пиримидиновые. Поэтому нуклеинавые кислоты повреждаются в основном через фотохимию пиримидиновых оснований. К настоящему времени выявлено несколько типов фотохимических реакций, ведущих к различным повреждениям ДНК: образование димеров тимина, урацила, цитозина, цитозин-тимина, тимин-урацила; гидратация цитозина и урацила; внутримолекулярные и межмолекулярные сшивки ДНК; сшивки ДНК — белок; разрывы сахаро-фосфатного остова нуклеиновых кислот.

4. ДИМЕРИЗАЦИЯ ТИМИНА

В 1958 г. Бькжерс, Иильстра и Берендс обнаружили, что при ультрафиолетовом облучении замороженных водных растворов тимина образуется фотопродукт, который позднее хроматографически был выделен в чистом виде и по молекулярному весу, элементарному составу, кристаллографическим, ИК-спект-роскопическим свойствам и растворимости идентифицирован как циклобутановый димер. Аналогичные диме-ры образуются в однонитевых полинуклеотидах и ДНК.

н

Смысл реакции фотодимеризации заключается в разрыве 5,6-двойной связи у обоих партнеров и образовании циклобутанового кольца:

Как прямая, так и обратная реакции имеют чисто фотохимическую природу и не требуют термической активации: в замороженных растворах тимина в интервале от 0 до —196° С скорость реакций не изменяется, т. е. <2ю=1,?акт = 0.

Из облученных модельных соединений, например тимидил-тимидина, с помощью тонкослойной хроматографии выделены четыре типа димеров с циклобутано-ным кольцом —два цис- и два тра«с-изомера:

Однако при облучении ДНК обнаруживается лишь

один цггс-димер типа I.

\50

Под действием коротковолнового света (например, К — = 235 нм) димеры моно0,5

0,1

0,05

1,0

0,5

Si

0,1

0,01 0,005

Рис. 45 тимииа

меризуются. Поскольку спектры поглощения ди-меров и мономеров, пере-крываясь, сильно различаются между собой (рис. 45), при длительном облучении для каждой волны возбуждающего света в спектральном интервале перекрытия устанавливается динамическое равновесие, при котором скорость прямой равна скорости обратной реакции. Так, известно, что для Х= = 285 нм отношение эк-стинкций димер/мономер в 1000 раз меньше, чем для Х=235 нм. Поэтому применение «насыщающего» облучения 239 нм после 290 нм, как показали Сетлоу и Кариэ, резко уменьшает концентрацию димеров в ДНК и политимидиловой кислоте. Изменение стационарного равновесия между димерной и мономерной формами в политимидиловой кислоте при переходе от длинноволнового к коротковолновому облучению иллюстрируется следующей схемой:

, , лдл 20% Т-Т \ор 90о/0 Т-Т

100% Т —Т—? ?—1 >- [—1.

80% Т — Т 10% Т — Т

Спектры действия образования и разрушения димеров в политимидиловой кислоте, как и следовало ожидать, близки по форме к соответствующим спектрам поглощения, хотя и имеют некоторые различия, о которых мы будем говорить ниже.

Вследствие бимолекулярного характера реакции фотодимеризации ее квантовый выход сильно зависит от концентрации и степени взаимоориентации мономеров в момент возбуждения одного из них. При идеальном стереометрическом соответствии мономеров (кристаллы моногидратов тимина) квантовый выход прямой реакции равняется 1. По мере нарушения этого соответствия квантовый выход реакции уменьшается для политимидиловой кислоты до 0,02, для дитимидило-вой до 0,01, для тимидил-тимидина до 0,003. Именно вследствие более благоприятной ориентации нуклеоти* дов димерообразование в политимидиловой кислоте при 77 К протекает в 5 раз быстрее, чем при 298 К. Процесс, однако, быстро прекращается и только после переориентации мономерных звеньев при замораживании — оттаивании образца идет дальше. Ориентационными нарушениями объясняется и резкое падение выхода димеров при температуре плавления нативной ДНК, которое не наблюдается у предварительно денатурированной ДНК.

Число образующихся в ДНК димеров тимина определяется количеством расположенных рядом тимино-вых остатков. По данным Корнберга с сотр., в ДНК М. lysodeicticus в такие пары включено около 1,8, а в ДНК фага Т2—11% всего тимина. В соответствии с этим в ДНК М. lysodeicticus димеризуется 1,2, а в ДНК фага Т2 — 5,7% всего тимина.

Вероятность образования димеров зависит также от вторичной и третичной структур ДНК. Подтверждением этому служат опыты Г. Б. Завильгельского и сотр., в которых была выявлена отчетливая корреляция между квантовым выходом димеризации тимидил-тими-дина и взаимоориентацией тимина, а также выходом образования летальных димеров в инфекционной фаговой ДНК и конформацией макромолекулы, контролируемой температурой и денатурирующими веществами. По расчетам японского исследователя Нагата, условия для димеризации наиболее благоприятны у тех конформаций ДНК (из всех возможных), у которых соседние остатки тимина ориентированы друг к другу под углом 36°.

Перейдем теперь к рассмотрению имеющихся данных по фотофизике процесса. Известны убедительные экспериментальные доказательства того, что предшественник фотодимеров тимина — первое триплетное состояние основания: 1) триплетные тушители (Ог, парамагнитные ионы) тормозят фотодимеризацию тимина; 2) к тому же результату приводит уменьшение заселенности триплетных уровней тимина (тест — тушение фосфоресценции) при триплет-синглетной миграции энергии с тимина ДНК на краситель профлавин; 3) ди-меры образуются в разбавленных растворах тимина, где временные промежутки между столкновениями значительно превышают время жизни их возбужденных синглетных состояний (10~12 с), но соизмеримы с временем жизни триплетов (10~6 с); 4) избирательное заселение триплетных уровней при триплет-триплетной миграции энергии от ацетофенона к тимину ДНК в растворе, а также в интактных фагах Т4 приводит к образованию димеров.

Однако на основании опытов по ингибированию ди-мерообразования в ДНК хлороквином, сопоставления спектральных зависимостей эффективности торможения димерообразования в ДНК этидиумбромидом (акцептор энергии) и квантовых выходов его сенсибилизированной основаниями флуоресценции Сазерлендом было высказано предположение о том, что часть димеров образуется «синглетным» путем.

Все же. к настоящему времени наиболее аргументирована точка зрения о преимущественно «триплетном» образовании димеров в ДНК при физиологических условиях. Отмеченное Сазерлендом некоторое несовпадение спектра действия димеризации со спектром поглощения тимина, заключающееся в возрастании квантового выхода фотохимической реакции с уменьшением длины волны света, может быть объяснено более эффективным заселением триплетных уровней тимина с высоких колебательных подуровней синглетного возбужденного состояния. Это хорошо согласуется с аналогичной зависимостью от длины волны облучения константы скорости интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние, полученной методом флеш-фотолиза.

В работах Айзингера с сотр. методом ЭПР было показано, что при ультрафиолетовом облучении в ДНК возникают свободные радикалы тимина. Однако ингибиторы свободнорадикальных реакций не оказывали существенного влияния на процесс фото димеризации. По всей видимости, роль свободнорадикальных состояний в образовании димеров тимина невелика и предшественником димера является все же не свободный радикал тимина, а его триплетное состояние. Можно думать в связи с этим, что сигнал ЭПР регистрируется скорее всего от тех тиминовых оснований, для димеризации которых нет стерических условий.

Есть все основания думать, что димеры образуются непосредственно из триплетного эксимера. Минуя стадию лабильного химического фотопродукта, эксимер, по-видимому, прямо превращается в стабильный фотохимический продукт — дим ер.

Как отмечалось выше, замыкание двух ковалентных С — С-связей между двумя молекулами тимина происходит в пятом и шестом положениях. Действительно, квантовомеханические расчеты показывают, что именно между пятым и шестым углеродными атомами в первом возбужденном состоянии наиболее высокая концентрация неспаренных электронов (спиновая плотность). При этом значительно уменьшается и подвижный порядок связи 5—6: двойная связь

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)