Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

уменьшают растворимость ДНК и способствуют ее геле-образованию. Известно, что квантовый выход образования межмолекулярных сшивок составляет Ю-2. По мнению Шугара, за образование сшивок ДНК—ДНК ответственны также тиминовые димеры, но, видимо, не цик-лобутанового типа.

14. СШИВКИ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА — БЕЛОК

Первым косвенным свидетельством фотохимического образования ковалентных сшивок между ДНК и белком было обнаруженное Смитом ухудшение экстраги-руемости ДНК из Е. coli, подвергнутой УФ-облучению. После обработки лизированных клеток трипсином экстрагируемость ДНК полностью восстанавливалась. В последующих работах Смита образование подобного рода сшивок было воспроизведено in vitro в смеси ДНК — бычий сывороточный альбумин.

Акцептором активного света являются оба компонента, поскольку предварительное облучение как белка, так и ДНК перед смешиванием сопровождается возникновением сшивок. На основании этого непосредственными предшественниками сшивок считают не синглет-ные или триплетные возбужденные состояния хромофоров, а некие долгоживущие продукты, возможно, свободнорадикальной природы. Смит обнаружил, что при облучении полирибоуридиловой, полирибоцитиди-ловой, полидезоксицитидиловой, полидезокситимидило-вой кислот, РНК и ДНК с цистеином происходит его химическое комплексирование с этими полинуклеотида-ми, и определил константы скоростей соответствующих реакций. Константа скорости взаимодействия цистеина с ДНК равна сумме коистант скоростей его взаимодействия с отдельными нуклеотидами.

В связи с этим можно полагать, что в реальных условиях сшивки нуклеиновой кислоты с белком происходят с участием прежде всего цистеина. В 1966 г. Смитом выделен и идентифицирован стабильный продукт взаимодействия урацила и цистина — 5-цистеин-6-гидроурацил.

Н

Однако позднее благодаря работам Джонса и Шетла-ра стало очевидным, что в модельных условиях кроме цистеина ковалентно присоединяться к урацилу при УФ-облучении могут еще десять аминокислот. В свою очередь высокую реакционную способность при образовании сшивок с аминокислотами проявляет и тимин. Джонс детально изучил образование смешанных фотопродуктов из тимина и цистеина. По его данным, УФ-свет индуцирует образование, по крайней мере, пяти различных фотопродуктов, которые хорошо разделяются и идентифицируются с помощью хроматографии.

Итак, в комплексе ДНК — аминокислота ковалентная связь образуется с участием отдельных оснований и прежде всего тимина и урацила, Смит полагает, что аминокислоты белков через SH- и ОН-группы присоединяются к пятому (или шестому) углеродному атому основания.

15. ДЕНАТУРАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Фотоденатурация нуклеиновых кислот является следствием разрушения кооперативной системы слабых нековалентных связей (водородные, гидрофобные и т. д.) и частичного (локального) или полного нарушения дву-спиральной структуры Уотсона — Крика (эффект «расплетания»). Наиболее вероятно, что денатурация нуклеиновых кислот представляет собой вторичный темновой процесс, вызванный образованием фотопродуктов, хотя не исключена возможность прямого разрыва слабых связей при тепловой диссипации энергии электронного возбуждения оснований, как это предполагается для белков. Несмотря на то, что спектр действия денатурации ДНК совпадает со спектром поглощения тимидина, причастность тиминовых димеров к образованию денатурированных участков в ДНК остается до сих пор сомнительной. Г. Б. Завильгельским твердо установлено, что локальные нарушения вторичной структуры ДНК при ее облучении коротковолновым светом определяются индукцией сшивок между комплементарными нитями ДНК. Наиболее точно такой вывод подтверждается опытами, в которых миграционным путем с ацетофенона на тимин изменялось количество тиминовых димеров в ДНК. При этом каких-либо различий в кривых плавления, отражающих состояние вторичной структуры, у образцов ДНК, содержащих 0,17 и 30% димеров, обнаружить не удалось. В то же время кинетика образования сшивок и локальных денатурационных участков в ДНК идентична.

Эффект денатурации можно выявить с помощью спек-трофотометрических, вискозиметрических, седиментаци-онных измерений, методами дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма, при изучении температур плавления спиралей, связывания формальдегида и красителей.

Чрезвычайно важно, что из-за выраженных кооперативных свойств макромолекул причиной функциональной инактивации могут быть не сами элементарные фотохимические повреждения, а последующие конформационные перестройки, затрагивающие систему слабых связей за пределами повреждения. Так, фотохимические повреждения т-РНК, локализованные вне антикодона, все же приводят к инактивации — нарушению комплементарного связывания антикодона т-РНК с кодоном и-РНК.

Известен и другой факт: фотоповреждения, локализованные в 30 S рибосомальных частицах, не влияют на их прямую функцию, но приводят к инактивации 50 S частиц, в состав которых входят заведомо другие молекулы р-РНК.

16. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Как известно, ультрафиолетовое облучение приводит к блокированию или модификации всех известных функций нуклеиновых кислот. При фотоповреждении ДНК ингибируются трансформирующая активность и способность к репликации и транскрипции, а также происходят различные мутационные изменения, затрагивающие ци-строны, кодирующие структуру всех белков, т-РНК и р-РНК. При локализации повреждения в и-РНК ингиби-руется процесс связывания ее с рибосомами и т-РНК, утрачивается трансляционная активность, искажается матричный смысл. Наконец, при прямом фотоповреждении т-РНК подавляется ее акцепторная активность к аминокислотам, изменяется структура антикодона и способность комплексироваться с рибосомами и кодонами и-РНК. Конечным результатом фотохимических повреждений нуклеиновых кислот являются гибель или разнообразные мутации, а также всевозможные физиологические изменения бактериофагов, клеток и организмов.

Очевидно, что биологическое значение могут иметь только те фотохимические реакции в растворах нуклеиновых кислот, которые приводят к образованию заметных количеств фотопродуктов уже в результате облучения минимальными биологически активными дозами УФ-света. Биологическую значимость различных фотоповреждений ДНК можно оценить, сравнивая данные, приведенные в табл. 12 и 13, составленных Сетлоу.

Если поперечное сечение (или вероятность) биологического эффекта намного больше поперечного сечения образования фотопродукта, то данный фотопродукт не играет существенной роли в конечном биологическом макроэффекте. Исходя из этих соображений, можно утверждать, что биологическая роль разрывов рибозо-фосфатного остова и поперечных сшивок ДНК сомнительна (см. табл. 12). Все остальные рассмотренные фотопродукты образуются в заметных количествах при облучении клеток биологически активными дозами (например, D37) УФ-лучей и принимают то или иное участие в различных биологических эффектах.

Таблица 12. Фотоповреждения ДНК

Виды повреждения Доза облучения, достаточная для одного повреждения, Дж/м' (X = 254 нм)

Молекула

ДНК <М~6-10») Е. coll Фаг Т2

Разрывы цепей ~ 2-10* 40 ~ 1103

Поперечные сшивки ДНК ~ 2-Ю4 40 -МО3

Сшивки ДНК — белок ~ 3-10» 6 ~ Ы0а

Гидраты цитозина (в денатурированной ДНК) ~ 10 0,02 - 0,5

Димеры тимина 5 0,01 ~ 0,25

Считается, что за 30% всех видов УФ-поражений в биологических объектах ответственны димеры тимина. В конечном счете парциальный вклад (П) каждого типа фотопродуктов в биологический эффект будет определяться тремя факторами: поперечным сечением поглощения (s), квантовым выходом фотохимической реакции (ф) и вероятностью биологической реализации элементарного повреждения (Р):

П = %<Р1Л/(%Фх*\ + ЗДз^з + • • • + ЗД,Л)Первый фактор, зависящий от нуклеотндного состава нуклеиновых кислот и их конформации, наименее вариабелен (плюс-минус десятки процентов).

Более лабилен квантовый выход отдельных реакций. Фотохимические реакции в полинуклеотидах нельзя рассматривать как сумму химических реакций мононуклео-тидов, нуклеозидов и азотистых оснований. Наконец, фотохимия нуклеиновых кислот зависит не только от их состава, но и от конформации макромолекулы (микроокружения). Например, скорость гидратации цитозина и урацила в нативной ДНК и полиуридиладениловой кислоте намного меньше, чем в денатурированной ДНК и полиуридиловой кислоте соответственно. Вероятность образования димеров между пиримидиновыми основаниями ДНК зависит от природы соседних оснований. Димерообразование подавлено в бактериальных спорах, в сухой ДНК и замороженных растворах ДНК. Этот процесс подавляется также связыванием интерка-ляционыых красителей.

Значение третьего фактора в наибольшей степени зависит от типа биологического эффекта (мутагенез, лизогения и т. д.), химического состава нуклеиновых кислот, активности репарирующих систем, т. е. от вида организма, его физиологического состояния и условий облучения. Итак, вклад различных фотоповрежденнй нуклеиновых кислот может достаточно широко варьировать и будет подробно проанализирован при рассмотрении отдельных видов биологических эффектов.

Глава XIII. Действие УФ-света на белки

?45

Рекомендуемая литература

Завильгельский Г. Б. Кинетика индуцированных «сшивок-» и локальных денатурированных участков в ДНК при УФ-облучении.— В сб.: Ультрафиолетовый свет, вып. 4. М., 1965, с. 137.

Brown J., Johns Н. Photochemistry of uracil. Intersysthem crossing and dimerization in aqueous solution — Photochem. and Photobiol., 1968, 8, 273.

Eisinger J., Lamola A., Longworth J., Gratzer W. Biological molecules in their excited states.— Nature, 1970, 226, 113.

Fisher G., Vargese A., Johns H. Ultraviolet-induced reactions of thymine and uracil in the presence-of cysteine.— Photochem. and Photobiol., 1974, 20, 109.

Kornhauser A. UV-induced DNA-protein links in vitro and in vivo,— Photochem. and Photobiol., 1976, 23, 457.

Lamola A. Excited state precursors of thymine photodimers.— Photochem. and Photobiol, 1968, 7, 619.

McLaren A., Shugar D. Photochemistry of proteins and nucleic acids

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)