Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

. Oxford, 1964.

Set low J. The effect of UV-radiation and photoreactivation.— In: Comprehensive Biochemistry. N. Y., 1967, v. 27, p. 157.

Smith K. Physical and chemical changes induced in nucleic acids by ultraviolet light.— Radiat. Res., Suppl., 1966, 6, 54.

Smith K- The biological importance of UV-induced DNA-protein cross-linking in vivo and its probable chemical mechanism.— Photochem. and Photobiol., ,1968, 7, 651.

S m i t h K-, A p 1 i n R. A mixed photoproduct of uracil and cysteine (5—S-systeine-6-hydrouracil). A possible model for the in vivo cross-linking of DNA and protein by UV-Hght— Biochemistry, 1966, 5, 2125.

Wacker A„ Dellweg H., Weinblum D. Strahlenchemische Veranderung der bakterien DNS in vivo.— Naturwissenschaften, I960, 47, 477.

Глава XIII. ДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО

СВЕТА НА БЕЛКИ

Наряду с нуклеиновыми кислотами белки относятся к одним из основных акцепторов биологически активного ультрафиолетового света в клетке. Деструктивно-модифицирующее действие ультрафиолетового света связано с фотохимическими повреждениями белковой макромолекулы. Кроме того, благодаря процессам миграции энергии, свет, поглощаемый белком, может использоваться для инициации фотохимических реакций в других хромофорах. Основные хромофоры белков — это остатки ароматических аминокислот: прежде всего триптофан и в значительно меньшей степени тирозин и фенил*

246

Глава ХШ. Действие УФ-света на белки

аланин. Они, а также цистин ответственны за функционально активное поглощение света.

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭЛЕКТРОННО-ВОЗБУЖДЕННЫХ СОСТОЯНИЙ БЕЛКОВЫХ ХРОМОФОРОВ

Поглощение света триптофаном и его остатками в составе полипептидной цепи белка (триптофаннлы) обусловлено системой сопряженных связей его индоль-ного кольца:

Н

И

Спектр поглощения триптофана характеризуется двумя полосами поглощения с максимумами при 220 и 280 нм. Молярная экстинкция в максимуме длинноволновой полосы около 5000, коротковолновой — около 32 000. Длинноволновая полоса поглощения обнаруживает слабо выраженную колебательную структуру. Обе полосы поглощения обусловлены я—п*-переходами в индольном кольце. Считается, что за длинноволновую полосу поглощения ответственны два электронных перехода: А JLa и А-^ осцилляторы которых лежат в плоскости индольного кольца и ориентированы друг к другу под углом 66°. Коротковолновая полоса сформирована одним электронным переходом А-э-Шь. Триптофан как в растворе, так и в составе белков обладает выраженной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра. Максимум спектра флуоресценции триптофана в водном растворе 350 нм. В составе белков положение максимума свечения колеблется от 328 до 350 нм в зависимости от свойств микроокружения хромофора. Квантовый выход флуоресценции триптофана в растворе составляет, по последним уточненным данным, 0,17, В составе белков величина этого параметра сильно варьирует — от 0,02 до

0,4. Длительность флуоресценции триптофана в воде 3 . Ю-9, в составе белка 2—4,6 • 10~9 с. Триптофан и трип-тофанилы белков при низких температурах интенсивно фосфоресцируют с т порядка 7 с и квантовым выходом около 0,1. В спектре фосфоресценции триптофана проявляются три отчетливых максимума: около 410, 440 и 480 нм.

Основной поглощающей группировкой в молекуле тирозина является фенольное кольцо:

ОН

i р

/Х—СН«—С—СООН

NH2

Спектр поглощения тирозина представлен двумя полосами с максимумами при 275 (е= 1250) и 222 нм (е=8000). Обе полосы образованы я—я*-переходами в сопряженной системе фенольного кольца. Тирозин в водном растворе флуоресцирует с квантовым выходом, равным 0,2, и длительностью 3,4-Ю-9 с. Максимум спектра флуоресценции тирозина в воде и белках расположен при 303 нм. Квантовый выход флуоресценции тирозина в белках очень низок из-за различных эффектов тушения, в основе одного из которых лежит образование водородной связи между фенильным гидроксилом и ближайшей ионизированной карбоксильной группой.

Длинноволновая полоса я—я*-поглощения фенил-аланина обнаруживает максимум при 258 нм и характеризуется низкой молярной экстинкцией (е=200). Фе-нилаланин обладает чрезвычайно слабой флуоресценцией (В=0,04), максимум спектра которой располагается при 282 нм. Флуоресценция фенилаланина в белках обычно не проявляется.

Поглощение УФ-света цистином, который не содер-жит двойных связей, а следовательно, и я-электронов, обусловлено а—о*-переходом, В области 200—300 нм спектр поглощения описывается монотонной кривой с возрастанием экстинкции по мере уменьшения длины волны. В области провала в спектрах поглощения триптофана и тирозина (250 нм) экстинкция цистина составляет около 200. Цистин не способен к флуоресценции и фосфоресценции и не передает миграционным путем поглощенную энергию триптофанилам.

2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОИНАКТИВАЦИИ

БЕЛКОВ

Конечным результатом действия ультрафиолетового света на белки является их инактивация, т. е. потеря ферментативной, регуляторной, гормональной, транспортной и иммунологической активностей. Фотоинактивация белков представляет собой одноквантовый, одно-ударный необратимый процесс, о чем свидетельствует экспоненциальный характер зависимости ферментативной активности от дозы облучения и взаимозаменяемость интенсивности и времени облучения. На одноударность процесса указывает также линейная зависимость скорости инактивации от интенсивности света, выполняющаяся даже при таких его интенсивностях, когда количество квантов, падающих в секунду на единицу объема, сравнимо с количеством молекул белка в нем.

Квантовые выходы инактивации различных белков характеризуются достаточно низкими значениями, находящимися в пределах 10~2—Ю-3. Это означает, что только один удачно поглощенный квант инактивирует макромолекулу, в то время как поглощение остальных 99—999 квантов не приводит к функционально существенным повреждениям. Квантовый выход фотоинактивации белков не зависит от содержания кислорода. Следовательно, инактивация не обусловлена фотоокисле-нйем хромофоров. Скорость фотоинактивации белков практически не зависит от температуры (Qio^l), во всяком случае для тех интервалов положительных температур, при которых конформация белка остается неизменной. Квантовый выход инактивации возрастает в области предденатурациониых температур и уменьшается в 3—4 раза при охлаждении образцов до —196° С. Эффективность фотоинактивации контролируется концентрацией водородных ионов (рН) и ионной силой среды, зависит от состава используемого буфера, а также от присутствия в растворах мочевины, гуанидина и детергентов. Перевод белка из раствора в твердую собственную пленку сопровождается падением квантового выхода**'" инактивации примерно в 3 раза. Обработка теплом и кислородом некоторых белков, облученных в вакууме, приводит к дополнительной темновой инактивации, которая объясняется накоплением в белках скрытых повреждений. На существование скрытых повреждений указывает также изменение чувствительности УФ-облученных ферментов к 5 М мочевине: облученные и необлученные белки инактивируются мочевиной с различной эффективностью.

3. РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ ХРОМОФОРОВ В ФОТОИНАКТИВАЦИИ БЕЛКОВ

Основную информацию о природе акцепторов биологически активного света дает метод спектров действия.

180 220 260 300 А,ш 180 220 260 300 А,им

Рис. 47. Спектры действия инактивации растворов альдолазы (/), грамицидина (2) и пленки химотрипсина (3) (McLaren A., Shugar D.,

1964)

Рис. 48. Спектр действия инактивации трипсина в пленке (/) и спектры поглощения трипсина (2) и цистина (3) (Setlow R., Doyle В., 1957)

В спектрах действия инактивации самых разнообразных белков отчетливо представлена полоса поглощения аро* матических аминокислот при 280 нм (рис. 47). Непосредственное участие триптофанилов в фотоинактивации белков подтверждается также защитным действием красителей — миграционных акцепторов энергии триптофанилов. При этом степень защиты пропорциональна тушению флуоресценции, т. е. уменьшению концентрации возбужденных молекул триптофана. Протективное действие обусловлено индуктивно-резонансной миграцией энергии с синглетных возбужденных уровней триптофанилов к синглетным уровням красителя. Наконец, для отдельных белков отмечается совпадение скоростей фотоинактивации белков и фотолиза триптофанилов в них.

Вклад фотохимии цистина проявляется в увеличении поперечного сечения инактивации богатых цистином белков в области 250 нм (рис. 48), где парциальное поглощение цистина сравнимо с поглощением ароматических аминокислотных остатков. По данным Сетлоу, при облучении различных белков светом с длиной волны 250 нм соблюдается прямая пропорциональность между содержанием в них цистина и величиной квантового выхода фотоинактивации. Тем не менее даже в белках, богатых цистином, при длинноволновом облучении (270—310 нм) преобладает «триптофановая» фотоинактивация, только при коротковолновом (240—260 нм) — щистиновая». В соответствии с этим белки, инактивированные коротко-и длинноволновым УФ-облучением, судя по данным се-диментационного анализа, различаются конечным кон-формационным состоянием.

Вторым основным методом идентификации акцепторов биологически активного света является хроматогра-фический анализ гидролизатов облученных белков, который позволяет определить, какие и сколько аминокислотных остатков разрушилось под действием света. Хро-матографический анализ аминокислотного состава облученных (?i=254 нм) химотрипсина и трипсина показал, что на одну инактивированную молекулу первого белка приходится один разрушенный остаток триптофана, а в случае трипсина — один остаток триптофана и два-три остатка цистина.

Если за фотоинактивацию действительно ответственны только кванты света, поглощаемые триптофаном и цистином, то поперечное сечение инактивации белка (сб) должно быть равно сумме поперечных сечений фотолиза триптофана (оТр) и цистина (оц) с учетом их числа (ттртц) в макромолекуле. При этом отр и 0ц определяются экспериментально на основании данных по фотолизу аминокислот в растворе или в белке:

Мак Лареном и Лузом для некоторых (но не всех) белков

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)