Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

было получено удовлетворительное совпадение расчетных и экспериментально определенных значений квантовых выходов (ф) фотоинактивации из соотношения ф=0/5, где s — поперечное сечение поглощения. Уязвимым местом в подобном подходе является произвольное предположение об одинаковой значимости фотолиза любой аминокислоты для инактивации макромолекулы и совпадении поперечных сечений поглощения и фотолиза аминокислот в свободном состоянии и в составе белка.

Значительно более корректны работы Ю. А. Владимирова с сотр., в которых определялись поперечные сечения инактивации белка и фотолиза входящих в его состав аминокислот не при одной, а при двух длинах волн: 254 и 280 нм. Это позволило им получить ответ на вопрос, приводит ли к инактивации деструкция любого, «первого попавшегося» остатка триптофана (или цистина), либо только определенного «ключевого» аминокислотного остатка. Составив систему уравнений

028O = mTpa2p8o + m4a28Of

авторы определили поперечные сечения фотолиза триптофана (аТр) и цистина (оц), а также количество тех остатков, разрушение которых сопровождается инактивацией. Таким способом было установлено, что у пепсина, содержащего четыре остатка триптофана и три остатка цистина, к инактивации приводит разрушение только одного из них. Деструкция остальных трех остатков триптофана и всех трех остатков цистина не приводит к инактивации фермента. Сходная картина наблюдалась и у трипсина. Из четырех остатков триптофана и шести остатков цистина критическое значение имели лишь один остаток триптофана и один остаток цистина. Из этих данных следует, что к инактивации приводит разрушение не всякого, а только строго определенного триптофаново-го или цистинового остатка. Таким образом, именно триптофан и цистин имеют первостепенное значение для фотоинактиващш белков.

ных (инактивированных)

Иные возможные элементарные фотохимические повреждения в белке — разрывы полипептидной цепи, фотолиз других алифатических, гетероциклических и ароматических аминокислот — не вносят решающего вклада в инактивацию. Так, гипотеза об инактивации белков через разрыв пептидных связей оказалась несостоятельной по следующим причинам: 1) согласно Мак Ларе-ну, квантовый выход фотолиза пептидной связи не превыщает 0,0003, что, по крайней мере, на порядок ниже квантового выхода инактивации белков; 2) при облучении химотрипсина и лизоцима даже такими дозами УФ-света, которые приводят к почти полной инактивации, заметного увеличения количества свободных аминогрупп не наблюдается. И только длительное облучение уже денатурирован-белков сопровождается их фрагментацией в результате прямых разрывов полипептидной цепи.

По аналогичным причинам несущественна роль реакций фотохимического дезаминирования и декарбоксили-рования аминокислот в белке, хотя протекание этих реакций четко регистрируется при облучении свободных аминокислот в растворе. Иными словами, фотохимия алифатических аминокислот и разрывы пептидной связи происходят только иа «трупе» белковой макромолекулы.

Следует подчеркнуть также, что хроматографический анализ белков, облученных умеренными дозами УФ-све4. Миграция энергии в белках

253

та, не выявил разрушения иных остатков аминокислот белка (в том числе и тирозинового остатка), кроме трип-тофанового и цистинового.

В заключение следует отметить, что некоторые белки, такие как инсулин, рибонуклеаза, отдельные фракции гистонов, вообще не содержат остатков триптофана. Они инактивируются ультрафиолетовым светом с низкой эффективностью благодаря фотодеструкции тирозиновых и цистиновых остатков (рис. 49).

4. МИГРАЦИЯ ЭНЕРГИИ В БЕЛКАХ

Белки содержат тесно сближенные и флуоресцирующие центры с известным перекрытием спектров — остатки ароматических аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Поэтому теоретически между ними возможна внутримолекулярая миграция энергии по индуктивно-резонансному механизму. Из расположения энергетических уровней вытекает, что миграция энергии может происходить в направлении фенилаланина тирозин триптофан ионизированный по фенильному гид-роксилу тирозин.

Действительно, многочисленные экспериментальные факты подтверждают этот теоретический прогноз. Наибольшее количество работ посвящено изучению миграции энергии от тирозина к триптофану. В опытах на модельных соединениях (ди- и олигопептидах, содержащих тирозин и триптофан) в спектрах возбуждения триптофановой флуоресценции выявлен вклад тирозинового поглощения — сенсибилизированная флуоресценция. Наибольшая эффективность миграции энергии отмечалась для тех соединений, в которых тирозин и триптофан непосредственно соединены между собой пептидной связью. Разделение тирозина и триптофана алифатическими аминокислотами в полипептиде, т. е. увеличение расстояния между ними, снижало эффективность миграции энергии. С помощью метода спектров возбуждения выявлен также тирозин-триптофановый перенос энергии и в белках. Так, по данным Кронмана и Холмса, эффективность миграции энергии у пепсина составляет 80, у карбоксипептидазы — 81, у трипсиногена — 91, у альдолазы — 34, у овальбумина — 27%. В ряде случаев экспериментально определенные значения эффективности миграции энергии хорошо коррелируют с расчетными, вычисленными по формуле Ферстера с использованием величины расстояния между хромофорами (данные рентгеноструктурного анализа). Например, три из четырех остатков тирозина в молочном альбумине

ю

находятся на расстоянии лишь 4—7 А от ближайших триптофанилов, и только для четвертого это расстояние

составляет 12 А. У другого белка — карбоксипептидазы А — из 19 остатков тирозина 15 удалены от триптофаниО)

лов на расстояние менее 15 А. Для обоих белков отмечается удовлетворительное совпадение теоретических и экспериментальных величин эффективности миграции энергии.

Данные, полученные методом спектров действия, подтверждаются и поляризационными измерениями: в области поглощения тирозина происходит деполяризация триптофановой флуоресценции. При этом форма поляризационного спектра флуоресценции сывороточного альбумина человека свидетельствует о том, что из каждых семи квантов, высвечиваемых триптофаном, три кванта возникают в результате миграции энергии от тирозиновых остатков.

В отличие от тирозин-триптофановой тирозин-тиро-зиновая и триптофан-триптофановая миграции энергии в белках выявляются только с помощью поляризационных измерений. Вебер зарегистрировал значительную по сравнению с флуоресценцией тирозина в растворе деполяризацию флуоресценции тирозинсодержащих белков инсулина, рибонуклеазы и зеина. Явление деполяризации флуоресценции характерно и для поли-/-тирозина.

Более сложная картина наблюдается в случае трипто-фан-триптофановой миграции энергии. Поскольку длинноволновая полоса поглощения триптофана сформирована двумя по-разному ориентированными осцилляторами— *Ъа и 4Ьь, эффект деполяризации может быть вызван не только миграцией энергии, но и изменением взаимоориентации и вклада различных осцилляторов в поглощение, обусловленным включением триптофана в состав белка. Однако сохранение эффекта деполяризации при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 296—302 нм в области, где поглощает только осциллятор lLa, указывает на протекание эффективной межтриптофановой миграции энергии. Этот вывод подтверждается и опытами, в которых время жизни флуоресценции триптофанилов искусственно занижено. Напомним, что эффективность миграции энергии существенно падает при уменьшении времени жизни флуоресценции донора энергии. В связи с этим показательны три серии опытов.

1. При повышении температуры от 20 до 30° С интенсивность, а следовательно, и время жизни флуоресценции кератина шерсти и фиброина шелка уменьшается, а степень ее поляризации возрастает с 5 до 10%. При последующем снижении температуры степень поляризации снова снижается до 5%.

2. При добавлении флуоресцеина к казеину наблюдается 20-кратное изменение интенсивности его трипто-фановой флуоресценции вследствие миграции энергии с триптофана на краситель и сокращение времени жизни возбужденного состояния. Параллельно степень поляризации флуоресценции казеина возрастает с 10 до 15—16%.

3. В гемоглобине, флуоресценция которого затушена, по крайней мере, на два порядка по сравнению с глобином благодаря эффективной миграции энергии с триптофанилов на гем, степень поляризации составляет около 20%. В то же время отрыв гема сопровождается ее уменьшением до 10%.

Наконец, в модельных соединениях (например, поли-/-триптофане), в которых хромофоры максимально сближены, флуоресценция полностью деполяризована.

Вполне понятно, что все поляризационные измерения проводились в условиях, при которых исключалась релаксационная деполяризация флуоресценции.

При рН>7 происходит ионизация фенольного гидро-ксила (R—ОН-э-R—О-), что приводит к длинноволновому сдвигу (А,тах = 297 нм) спектра поглощения тирозина. В результате этого становится возможной миграция энергии с тирозина и триптофана на тирозинат. В эксперименте подобная миграция энергии регистрируется по тушению флуоресценции донора. Такой эффект был обнаружен при рН=9—11 у инсулина, рибо-нуклеазы, лизоцима, папаина. По данным Эдельхоха, эффективность миграции в дипептиде триптофанил-тиро-зине от триптофана к тирозинату составляет 85%. В соответствии с теорией индуктивно-резонансного переноса в серии олигопептидов триптофанил-(глицил)п-тиро-зин тушение триптофановой флуоресценции уменьшалось с увеличением п. При п>4 из-за увеличения расстояния между донором и акцептором энергии (R^>Ro) миграция энергии с триптофана на тирозинат полностью прекращается и тушение флуоресценции триптофана уже не наблюдается.

Наряду с рассмотренными внутримолекулярными процессами миграции энергии белковым системам свойствен также межмолекулярный перенос энергии. Такой перенос может осуществляться между ароматическими аминокислотами белков и простетическими группами НАДН2, ФАДом, гемом, ретиналем, билитрие-нами, витаминами, пигментами, хлорофиллом, кароти-ноидами и т. д.

Следует подчеркнуть, что миграция энергии между ароматическими аминокислотами може

страница 45
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(06.12.2019)