Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

смешанные спектры летального эффекта с максимумами при 260 и 280 нм, указывающие на то, что в ак-« цепции света, приводящего к гибели клетки, участвуют и белки и нуклеиновые кислоты.

Слабым инактивирующим действием на клетки обладает и ближний УФ-свет (Л>320 нм). Чтобы получить летальный эффект при облучении ближним ультрафиолетовым светом, необходимы дозы в 105 раз большие, чем при использовании среднего ультрафиолета.

_1 I I гЬ- {/,(//\ I 1 1 I

240 260 280 300 А,ш 220 240 260 280 1,нм

Рис. 51. Спектры действия вируса гриппа (McLaren A., Shu-gar D., 1964):

а — подавления инфекционной активности (1) и гемагглютниацнн (2); б—деструкции (I) и способности к интерференции (2)

Механизм действия ближнего света изучен недостаточно. Имеются лишь данные о том, что летальный эффект света с длиной волны более 320 нм может быть связан с непрямым повреждением ДНК. Дальний ультрафиолетовый свет (Х<200 нм), наоборот, весьма эффективен, что может быть обусловлено его ионизирующим действием.

2. ИНАКТИВАЦИЯ ФАГОВ И ПЛАЗМИД

Очень удобной моделью для изучения молекулярных механизмов действия УФ-света являются фаги. Их строение достаточно просто — одна молекула ДНК или РНК и белковый чехол. Как и все вирусы, фаги не обладают собственным метаболизмом.

Квантовый выход инактивации различных фагов колеблется от Ю-2 до 10~5. Потеря фагом биологической активности может быть результатом повреждения нуклеиновой кислоты (тогда он теряет способность к размножению) или белкового чехла (тогда фаг неспособен проникнуть в клетку).

Как правило, потеря вирулентности осуществляется по одноударному механизму и имеет «нуклеиновый» спектр действия (рис. 51, 52). Дополнительное облучение уже инактивированного фага повреждает по многоударному механизму его чехол (белковый спектр действия), что связано с фотоденатурацией многих молекул белка (см. рис. 51). Однако у некоторых фагов фоточувствительность нуклеинового и белкового компонентов соизмерима. Так, белковый спектр действия с максимумом при 280 нм (см. рис. 51) был получен для подавления способности к агглютинации вируса гриппа. У некоторых фагов (бактериофаг Bad. megatherium, фаг Т1 и др.) в спектрах действия потери инфекционной активности наряду с более значительным нуклеиновым максимумом при 260 нм представлен и белковый максимум при 280 нм.

Появление белкового максимума может быть обусловлено повреждением чехла с потерей фагом сорбци-онно-проникающих свойств, повреждением ДНК свобод-норадикальными продуктами фотолиза белка и сшивками ДНК — белок. Если учитывать величины квантовых выходов всех трех процессов, последняя причина кажется наиболее вероятной.

Тем не менее у фагов основным хромофором и субстратом для фотохимических повреждений является нуклеиновая кислота, а не белок. Так, Сетлоу и Бойсом было показано, что квантовый выход инактивации фага фХ174 в пересчете на поглощение нуклеиновой кислоты почти не изменяется в спектральном интервале 235— 280 нм. Постоянство квантового выхода фотопроцесса в пределах полосы поглощения активного света, как известно, свидетельствует об однородности хромофора. Подавление инфекционной активности мало зависит и от того, облучается ДНК фага или целый фаг.

В отличие от этого фоточувствительность свободной РНК выше, чем в интактном вирусе табачной мозаики (ВТМ), что может быть обусловлено защитным эффектом белкового чехла или различиями в конформации нуклеиновой кислоты в растворе и фаге. В этой связи большой интерес представляют опыты Мак Ларена, показавшего, что два различных штамма вируса табачной мозаики (U1 и U2) обладают различными квантовыми выходами инактивации в водной суспензии, но характеризуются одинаковой фоточувствительностью изолированных РНК, и квантовый выход инактивации реконструированных вирусов, состоящих из РНК U1 +белок U2 и РНК U2-f-белок U1, определяется фоточувствительностью белкового донора. Результаты этих опытов скорее всего можно объяснить тем, что белковая оболочка при образовании гибридных вирусов способствует возникновению своей «комплементарной» конформации РНК, которая и определяет уровень фоточувствительности вируса.

Характер элементарных фотохимических реакций в нуклеиновых кислотах, приводящих к гибели фагов, в настоящее время более или менее ясен. Инактивация ДНК-содержащих фагов, по-видимому, связана с фото-дилеризацией, а не фотогидратацией оснований, поскольку после пострадиационной тепловой обработки, достаточной для разрушения гидратов, их активность не восстанавливается.

На доминирующую роль пиримидиновых димеров и прежде всего димеров тимина в гибели фагов прямо указывают опыты Г. Б. Завильгельского с сотр. Ими была обнаружена прямая пропорциональная зависимость между абсолютным числом тиминовых остатков и поперечным сечением инактивации у природной и реплика-тивной однотяжевой ДНК фага <рХ174. Хроматографиче-ский анализ гидролизированной ДНК фагов Т4 и фХ174, облученных биологическими дозами ультрафиолетового света, выявил тиминовые и урацил-тиминовые димеры.

Наконец, летальные УФ-повреждения ДНК фагов фо-тореактивируются. Так, после проникновения в клетку-хозяина активность Т-фагов возрастает примерно в 1000 раз при облучении видимым светом. Этот факт — наиболее веский аргумент в пользу тиминовых димеров, поскольку именно они элиминируются в ходе фотореактивации.

Характерно, что для большинства фагов число димеров, возникших под действием УФ-света, больше числа летальных ударов. Так, по расчетам Зауербира и Хауга, только один из семи димеров приводит к инактивации фага Т4. Это может в первую очередь означать, что роль различных участков ДНК неравноценна и димеризация оснований в значительной части ДНК не приводит к инактивации. Иначе говоря, в цепи ДНК существуют критические и некритические участки.

Повреждения в некритических участках приводят к ненаследуемым эффектам (удлинение латентного периода одноступенчатого цикла размножения, периода лизиса) у бактериофагов, имеющих двухтяжевую ДНК или РНК. Эффект удлинения латентного периода носит кумулятивный характер, и для него, как и для обычного летального эффекта, характерно явление фотореактивации. Это означает, что ненаследственные повреждения в некритических участках ДНК, по-видимому, имеют димерную (Т—Т) природу (чем больше повреждений, тем длительнее латентный период), и в спектре их действия, как правило, обнаруживается нуклеиновый максимум.

Инактивация РНК-содержащих вирусов протекает с участием не только одних пиримидиновых димеров. Существенный вклад в инактивацию вносят и гидраты оснований. Например, из РНК облученного вируса табачной мозаики выделены следующие фотопродукты: пири-мидиновые гидраты, два типа циклобутановых димеров и два фотопродукта неизвестной природы. При этом на один летальный удар приходилось 1,2 гидратов урацила, 0,9 гидратов цитозина и 0,8 пиримидиновых димеров (из них 0,5 циклобутановых). Возникновение при УФ-облу-чении различных типов повреждений ВТМ подтверждается наличием фотореактивируемых и нефотореактивируемых дефектов в РНК вируса табачной мозаики, а также зависимостью соотношения данных дефектов в РНК от длины волны облучения.

УФ-свет эффективно инактивирует и плазмиды — вне-хромосомные ДНК бактериальных клеток. Плазмиды представляют собой двухцепочечные кольца, закрученные в суперспираль. В бактериальной клетке представлено около 20 мелких (М~5«106) и 1—2 крупных (М~ 108) плазмид. Основной вклад в инактивацию плаз-мид вносят пиримидиновые димеры. При этом, как показано Г. Б. Завильгельским, скорость УФ-инактивации плазмид не зависит от их молекулярного веса. Такой вывод сделан на основании экспериментов, в которых облучали набор плазмид, отличающихся друг от друга весом встроенного в их структуру фрагмента ДНК Е. coli. В то же время эффективность сенсибилизированной 8-меток-сипсораленом инактивации (за счет межнитевых сшивок) была пропорциональна молекулярному весу плазмиды. Кроме того, был сделан и другой важный вывод о том, что эффективность репарации пиримидиновых димеров определяется молекулярным весом плазмиды (см. гл. XVII).

Итак, при облучении фагов и плазмид биологически активный свет поглощается преимущественно нуклеиновыми кислотами. Основная фотохимическая реакция, приводящая к их гибели,— образование пиримидиновых димеров и в первую очередь димеров тимина. У РНК-со держащих вирусов определенный вклад в инактивацию вносят также фотогидраты оснований.

3. ИНАКТИВАЦИЯ КЛЕТОК

Летальное действие УФ-света на клетки проявляется, как правило, не в мгновенной их гибели под лучом, а в утрате способности к многократному воспроизведению. Такие клетки могут до первого или второго деления нормально выполнять свои физиологические функции. Поэтому самым распространенным тестом на летальное действие УФ-света служит потеря клетками способности формировать микро- или макроколонии.

Микроорганизмы — наиболее традиционный объект для изучения действия УФ-излучения на клетки. Их чувствительность к УФ-свету широко варьирует в зависимости от вида. Например, доза света с длиной волны 254 нм, необходимая для подавления способности к образованию колоний на 90% (LD90), равна для Bad. megatherium 113, а для М. radiodurans 1600 Дж/м2.

По степени возрастания фоторезистентности одноклеточные организмы можно расположить в следующий ряд: микробы (палочки—кокки) >грибы (гаплоидные дрожжи и актиномицеты — диплоидные дрожжи — полиплоидные дрожжи — плесневые грибы) >водоросли (хлорелла — хламидомонада) >простейшие. Рекорд по фоторезистентности у простейших принадлежит жгутиконосцу Bodo marino (LD90=11 200 Дж/м2). Еще большие дозы необходимы для подавления прорастания (летальный эффект) пыльцы высших растений: LD37= 105—106 Дж/м2.

Резистентность клеток животных и человека в культуре относительно низка: LD90=104-50 Дж/м2. Как правило, пигментированные клетки более устойчивы к свету, чем непигментированные, а диплоидные и полиплоидные устойчивее, чем гаплоидные.

Меняется фоточувствительность и в ходе жизненного цикла клетки. Из четырех периодов развития клетки — Gi (постмитозны

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)