. ^21 * * • kni

кц 2 kaj • • ¦ кп2

к1п к2п ""' 2 knj

Этот определитель имеет следующие свойства.

1. Он не содержит констант Ат/- (у которых первым индексом является т), поэтому выражение, пP?лучаемое после разложения определителя, также не будет содержать этих констант.

2. Константы с одинаковым первым индексом находятся в одном и том же столбце. Поскольку каждое произведение констант в разложении определителя должно содержать по одному члену из каждого столбца, в разложении отсутствуют произведения, вглю-чающие две или более констант с одним и тем же первым индексом, и каждый индекс, отличный от т, должен встречаться в качестве первого индекса в каждом произведении только один раз.

3. Каждая константа ktj, где i т и / =^= т, встречается в определителе дважды: один раз как недиагональный элемент, а другой — как один из членов суммы Sktj. Это обстоятельство приводит к следующему важному результату: каждое произведение, содержащее цикл индексов (например, произведение ktik^c3t с циклом индексов 1 —»- 2 —>- 3 —>-1), в разложении определителя должно сокращаться (заметим, что в произведении каждый из индексов встречается один раз как первый индекс, а другой раз— как второй). Для того чтобы убедиться в этом, проще всего рассмотреть конкретный случай, например произведение fc12&23fc31. Это произведение встречается в виде (—ki2)(—к23)(—k3i) [что является частью произведения (—2A?i,)( —2 k2j)( —2 k3j)] с сомножителями, являющимися элементами других строк и столбцов

N = е

1' т — е0

Как выводить уравнения стационарной скорости

59

определителя, а также в виде 4-Ai2fc2Sfc3i (из недиагональных элементов) с сомножителями, являющимися теми же самыми членами из других строк и столбцов определителя. Вначале произведение имеет положительный знак, поскольку для того, чтобы переместить соответствующие элементы на главную диагональ, требуется четное число перестановок столбцов (речь идет о перестановках столбцов 1 и 2, затем столбцов 1 и 3). Таким образом, для каждого произведения, которое содержит член —kt2ku3kst, составленный из диагональных элементов, найдется равное ему по величине и обратное по знаку произведение, содержащее член -{-к1гкй3кд1, который составлен из недиагональных элементов. В общем случае, если число констант в цикле является нечетным (как в рассмотренном примере), для того чтобы переместить недиагональные элементы на главную диагональ, потребуется четное число перестановок и в результате знак произведения будет положительным; однако соответствующее произведение из элементов главной диагонали будет содержать нечетное число отрицательных членов и иметь поэтому отрицательный знак. Если число констант в цикле является четным, то картина будет обратной и, следовательно, в любом случае произведения будут взаимно уничтожаться. Итак, мы можем заключить, что все произведения констант, содержащие циклы индексов, из разложения определителя исключаются.

4. Любое произведение, содержащее недиагональный элемент, должно содержать по меньшей мере еще один недиагональный элемент, поскольку присутствие в произведении какого-либо Недиагонального элемента исключает присутствие в нем двух диагональных элементов (например, если в произведение входит третий элемент четвертой строки, то как третий, так и четвертый диагональные элементы уже не могут присутствовать в этом произведении, поскольку оно должно содержать только один элемент из каждой строки и только один элемент из каждого столбца). Операцию по выбору недиагональных элементов можно считать законченной, если мы дошли до элемента, первый и второй индексы которого уже использовались ранее как второй и первый; иными словами, цикл должен быть завершен. Однако мы видели, что все произведения, составленные из элементов, индексы которых образуют цикл, должны сокращаться. Следовательно, все произведения, которые входят в окончательное разложение определителя, составлены исключительно из диагональных элементов. Поскольку все константы, расположенные на диагонали, отрицательны, все произведения в разложении должны иметь один и тот же знак [положительный, если (п — 1) число четное, и отрицательный, если нечетное].

5. Мы видели (см. пункт 2), что каждый индекс, за исключением индекса пг, должен встречаться в качестве первого индекса по меньшей мере один раз. Каждое произведение содержит (п — 1) кон-

60

Глава 3

стант, и поэтому индекс т по меньшей мере один раз должен встречаться в качестве второго индекса. Если бы это условие не выполнялось, то каждый индекс, который встретился в качестве второго индекса, должен был встретиться также в качестве первого индекса и произведение должно было содержать не менее одного цикла.

6. Каждый диагональный элемент —2Аг/- содержит константы, имеющие все возможные вторые индексы, за исключением i. Следовательно, каждое произведение, не противоречащее предыдущим требованиям, должно присутствовать в конечном разложении.

Итак, суммируем вкратце все вышесказанное. Разложение числителя уравнения (3.2) представляет собой сумму произведений in. — 1) констант к и, в каждом из которых(1) т не встречается в качестве первого индекса, (2) каждый другой индекс встречается как первый индекс только один раз, (3) отсутствуют члены, индексы которых образуют цикл, (4) все произведения в указанной суМме имеют одинаковый знак, (5) т в каждом произведении встречается по меньшей мере один раз в качестве второго индекса, (6) в сумме присутствуют- все произведения, не противоречащие указанным требованиям.

После столь подробного анализа числителя выражения (3.2) нам очень приятно отметить, что разбирать так же детально знаменатель нет необходимости. Действительно, для всех форм фермента знаменатель имеет одно и то же значение, и, поскольку общая концентрация всех форм "должна составлять е0, он должен быть равен сумме всех возможных числителей, деленной на е0. Учитывая это обстоятельство, а также тот факт, что все возможные числители имеют один и тот же знак, мы приходим к заключению, что знаменатель должен иметь тот же знак, что и числители и, следовательно, отношение должно быть положительным. Это естественно, поскольку все концентрации по своему физическому смыслу должны быть положительными величинами.

До сих пор мы предполагали, что взаимные переходы возможны для всех пар форм фермента. На самом деле это, конечно, не так, однако отсутствие определенных переходов легко учесть, приравняв к нулю значения соответствующих констант скорости. Произведения, в которые входят эти константы, будут равны нулю, и поэтому их можно опустить.

Еще одно обстоятельство, не учтенное выше, состоит в том, что между двумя формами фермента могут протекать две или более параллельных реакций. В этом случае общая скорость как прямой, так и обратной реакций будет представлять собой сумму индивидуальных скоростей. Следовательно, любую константу кц можно представить в виде суммы констант скорости для параллельных реакций.

Как выводить уравнения, стационарной скорости

61

Все произведения констант скорости, обсужденные в этом разделе, могут рассматриваться как «деревья» или пути (см. разд. 3.3), ведущие из одной конкретной формы к каждой из остальных форм. Поэтому метод, описанный я следующем разделе, прямо следует из проведенного выше обсуждения.

3.3. Метод Кинга — Альтмана

Рассмотрим метод, основанный на применении схем, с помощью которого можно вывести уравнение скорости для любого механизма ферментативной реакции. В качестве Примера возьмем один из основных двухсубстратных механизмов:

"е + а^еа,

*- ..*. Г:

ЕА + В^ЕАВ,

EAB EPQ, EPQ J? EQ + Р,

•EQ ^ E+Q.

Для третьей стадии константы скорости не указаны, поскольку измерения стационарной скорости не дают информации об изомеризации между промежуточными соединениями, в ходе которой не происходит связывания или высвобождения реагентов (обсуждение этого вопроса см. в разд. 3.7). Составляя соответствующие уравнения и анализируя их, мы должны поэтому рассматривать EAB и EPQ как одну и ту же форму, хотя с точки зрения механизма процесса было бы правильнее считать их отдельными формами.

Первый этап в выводе уравнения скорости по методу Кинга — Альтмана состоит в том, что механизм ферментативной реакции представляют в виде схемы, в которой указываются все формы фермента и реакции между ними:

62

Глава 3

Все реакции должны быть представлены как реакции первого порядка. Например, константа скорости k+t заменяется константой скорости псевдопервого порядка &+1а умножением на концентрацию реагента А.

Следующий этап — построение основного графа, являющегося скелетом схемы; в рассматриваемом случае это квадрат:

Затем выбирают подграфы (деревья), удовлетворяющие следующим условиям: 1) подграф состоит только из линий, входящих в основной граф; 2) подграф связывает все формы фермента и 3) подграф не содержит циклов. Число ребер в каждом дереве на единицу меньше числа форм фермента; в нашем случае подобных дерева четыре:

Далее для каждой формы фермента ж для каждого дерева записывают произведение констант скорости, соответствующих ребрам, направленным к выбранной форме. Например, для формы EQ второе дерево

Ar-i

к*

дает произведение k_ik+3k+iq. В этом дереве ребра ориентированы (или подразумевается, что ориентированы) таким образом, что из любой исходной вершины стрелки направлены к соответствующей форме EQ, причем эта форма соединена с любой другой формой только одной стрелкой. Это условие обеспечивает выполнение требований, определяемых правилами 1, 2 и 5 предыдущего раздела. Выполнимость остальных правил обеспечивается описанным выше принципом выбора подграфов. Так как число деревьев равно четы-, рем, для каждой формы фермента можно записать четыре произведения, аналогичных тому, которое было выписано для формы EQ во втором дереве. В таком случае доля каждой формы в смеси в

Как выводить уравнения стационарной скорости

63

условиях стационарного протекания реакции равна сумме четырех произведений, деленной на сумму всех шестнадцати произведений (2):

[Е]/е0 = (A-tA-afc+i + А.^А^