+ А+2А+3А+4Ь + А_,А_2А_3ю)/2, (3.3)

[ЕА]А?0 = (А+,А_2А+4а + А+,А+3А+4а + А_2А_3А_4рд + А+,А_2А_3аю)/2,

[ЕАВ]/+ A+,A+sA_3aiu3)/2,

[EQ]/Скорость реакции будет равна сумме скоростей стадий, ведущих к образованию определенного продукта, минус сумма скоростей стадий, в которых этот продукт расходуется. В рассматриваемом случае имеется одна стадия образования Р, стадия (EAB —

—EPQ)-->¦ EQ, и одна стадия расходования Р, стадия EQ--*-

->- (EAB—EPQ), и поэтому мы имеем

» = = А+3[ЕАВ]-A_3[EQ]p = at

= еа (А+1А+2 А+3 А+4 аЪ + А_, A+s А_3 А_4 pq + А+2 А+3 А_3 А_4 bpq + -f- А+| А+2 А+3 А_3 аЬр А_4 А_2 А_3 А_4 pq А_4 А+а А_3 А_4 pq — — А+2 А+3 А_3 А_4 bpq — А+, А+2 А+3 А_3 аЬр)/% = = еа (А+,А+2А+3А+4 ab — k_tk^k_3k_k pq)/^.

Поскольку обычно измерить все индивидуальные константы скорости невозможно, имеет смысл представить уравнение скорости в форме, содержащей вместо кинетических констант коэффициенты:

р__gpfciflb — ciPq)_

«s + с*° + c»b + свр + c,g + Cgob + c8ap + c10bq + cllPq + claaop + ci3b/>3 *

где

ci = A+i A+2 A+3 A+4, c2 = A_j A_2 A_3 A_4, cs — A_i (A_2 -j- A+3) A+4, c4 == A+i (A_2 -j- A+3) A+4, c5 ~ A+2 A+3 A+4, Ce = A_t A_2 A_3 , c-i = A_j (A_2 rf- A+3) A_4, c8 = A+1A+2 (А+э -J- A+4), c8 = A+i A_2 A_3,

64

Глава 3

cl0 = ft+2 к+3 k_k,

с1а = k+ik+ik_3, с1з — к+2.к-зк_ь.

Такая форма записи позволяет легко предсказать кинетические свойства ферментативной реакции, для которой выполняется данный механизм. .

В стационарном состоянии концентрации всех форм фермента постоянны. Отсюда непосредственно вытекает, что вещество Q образуется с такой же скоростью, что и Р, а А и В расходуются с одинаковой скоростью. Поэтому не имеет значения, какой именно реагент рассматривается при выводе уравнения скорости. Отметим, что выражения для dqldt, —da/dt и —dbldt полностью идентичны выражению для dp/dt, которое получено выше-.

3.4. Варианты метода Кинга — Альтмана '

Метод Кинга и Альтмана в том виде, как он здесь представлен, очень удобен для анализа любых более или менее простых механизмов ферментативных реакций. Однако для сложных механизмов, как правило, приходится отыскивать очень большое число деревьев. В таком случае вывод уравнения скорости становится весьма трудоемким и очень просто ошибиться, пропустив отдельные деревья или включив неправильные члены. Хотя задача подсчета общего числа деревьев в принципе разрешима, этот расчет (если не говорить об очень простых механизмах) весьма громоздкий, поскольку необходимо вводить поправки для каждого цикла реакций в обсуждаемом механизме. Так или иначе, даже знание числа деревьев не очень облегчает их отыскание и не сокращает времени, необходимого для выписывания соответствующих членов. В общем случае для сложных механизмов лучше всего попытаться упростить сам метод вывода уравнения скорости. С этой целью Воль-кенштейном и Гольдштейном [146] был предложен ряд правил; они использовали теорию графов для потоков, разработанную Мэ-зоном [110, 111] для анализа электрических цепей.Простейшие из этих правил таковы:

1: Если для одной и той же пары форм фермента имеется две или более стадий.взаимопревращений, то, сложив константы скорости параллельных реакций, эти стадии можно слить в одну. Например, согласно Кингу — Альтману, механизм Михаэлиса — Ментен может быть представлен как

Как выводить уравнения стационарной скорости

65

К s

к*2

и дает, следовательно, два дерева: ' 4 и__Поскольку одна и

та же пара форм фермента связана двумя реакциями, последние могут быть объединены:

Б ES.

Эта схема сама по себе является одним деревом, и поэтому

[Е]/е0 = (&_, + к+2)/(к.± + к+2 + + k_zp),

[ES\/e0 = (k+ls + к.2р)/(к_л + k+2 + k+is + Л_2р).

В более сложных случаях упрощение от использования этого приема еще существеннее. В качестве одного из примеров Кинг и Альтман рассмотрели общий механизм действия модификатора (механизм Боттса и Моралеса [16]):

S

Р

Для этого основного графа необходимо построить двенадцать деревьев. Если же объединить параллельные пути, то получится квадрат, для которого необходимо построить только четыре дерева.

2. В том случае, когда механизм ферментативной реакции предполагает наличие различных форм фермента, обладающих идентичными свойствами, метод существенно упрощается, если рассматривать такие формы как одну. Например, если молекула содержит два идентичных активных центра, то соответствующий механизм представляется следующим образом: 3—282

66

Глава 3

Для этого механизма необходимо построить 32 дерева. Однако, поскольку ES и SE идентичны, граф симметричен относительно пунктирной линии и может быть существенно упрощен:

ES

Дальнейшее упрощение можно получить, применив правило .1:

Е

2*+1s

ES

ESa

Таким образом, граф, требующий построения 32 деревьев, упростился до графа, представляющего собой одно дерево; это позволяет сразу получить выражения для концентрации трех форм фермента:

[Е]__2(*-1 + *м)(*ч + *м)_

«о 2 (fc_i + fc+2) (fc_s + fe+j) + 4fe+i (fc-3 + hi) s + 2k+i Ks «s

и т. д.

Во всех случаях, когда, используя симметрию основного графа, сводят его к более простому, следует вводить статистические множители. В последнем примере реакция Е —>- ES может протекать по двум путям, поэтому полная скорость реакции равна сумме двух скоростей, а константа скорости для объединенного пути — удвоенному значению любой из индивидуальных констант скорости. Напротив, обратная реакция может протекать толь-

Как выводить уравнения стационарной скорости

67

ко по одному пути и поэтому характеризуется статистическим фактором, равным единице. Следовательно, схема

е5

:ES

rC+lS

превращается в схему

SE

Е

2*+iS -->

I--

ES.

3. Если основной граф состоит из двух или большего числа обособленных частей, «соприкасающихся» в точках, соответствующих одной, общей для обеих частей форме, то удобно анализировать эти части порознь. В качестве простого примера можно рассмотреть случай конкурентных субстратов, когда один фермент катализирует одновременно две реакции с различными субстратами:

В этом случае каждое выражение, определяющее концентрацию той или иной формы фермента, представляет собой произведение соответствующих сумм для левой и правой частей основного графа:

Левая

>

Правая;

U* Г4* > v|. *1 <

[Е]/в0 — (Л+м k+i3 -j- &_21 &_22 ~Ь ^-21 &+2з) x

x (k+t2 k+l3 + А_ц k_i2 -f- k_u k+t3)/^, [EA]/e0 = (k+22 k+i3 + k_M k_22 + ft_2, ft+23) x

x (Al12k_i3p + k+uk_l2a + k+ttk+i3a)/?,

8*

68

Глава 3

?ЕР]/е0 — (&+22 ''ч-гз 4~ к-и ~Ь ^-21 ^+аз) X

X (k+t2k_13p 4- Л+12а 4- k_it fc_i3p)/2>

[ЕВ]А?0 = (Л_22 ft_23ff 4- Ar+21 ft_22b 4- fc+2, ft+23fc) X

X (A;+i2 k+i3 4- &_ц A_!2 4" k_u &+is)/2»

[EQ]A?0 = (A+22 k_i3q 4- A+2, A+22b 4- ft_2l Л_2з9) X

X (Л+12Л+134-Л_цк_iz~\-k_цА+1з)/2-

Это правило можно рассматривать как особый случай подхода, который мы обсудим в следующем разделе. Однако, поскольку оно очень удобно с практической точки зрения, мы сочли целесообразным обсудить его отдельно.

Существуют и другие способы вывода уравнения скорости, направленные на усовершенствование метода Кинга и Альтмана. Среди них стоит отметить метод Фромма [58], который может оказаться полезным для тех, кто предпочитает алгебраические операции геометрическим. Совершенно ясно, что любой метод, если он корректен, должен приводить к одному и тому же уравнению скорости реакции.

3.5. Представление графов в более компактной форме

Наиболее полезным является четвертый вариант метода Кинга— Альтмана, введенный Волькенштейном и Гольдштейном (фактически третий по их нумерации): это единственный практический метод анализа сложных механизмов, включающих шесть или более форм фермента. К сожалению, он также наиболее труден для понимания и практического использования, поскольку требует особого внимания и не может быть применен чисто механически, если хотят использовать все его возможности. По своей сути вариант Волькенштейна и Гольдштейна представляет собой способ выявления и использования повторяющихся особенностей основного графа, который позволяет получать соответствующие члены для нескольких деревьев одновременно.

Рассмотрим следующий механизм, соответствующий двухсуб-стратной-двухпродуктной реакции, в котором связывание субстратов и высвобождение продуктов могут происходить в любом порядке:

Как выводить уравнения стационарной скорости

69

Ясно, что к такому сложному механизму вряд ли удастся применить метод Кинга—Альтмана в оригинальной форме, без каких либо упрощений, потому что для этой цели необходимо построить 32 дерева и, следовательно, очень легко ошибиться.

Из рассмотрения путей, заканчивающихся на EAB, ясно, что каждое правильно составленное дерево должно содержать пять линий и включать один и только один из маршрутов Е ->-->ЕАВ, Е -у KB -v EAB, Е->-ЕР -v EAB или E-*EQ ->- EAB. Любое дерево, включающее маршрут Е -*- ЕА —>- ЕАВ, должно содержать также либо ветвь ЕВ ->- Е, либо ветвь ЕВ ->- ЕАВ, но не обе ветви одновременно, чтобы, с одной стороны, обеспечить связь с ЕВ, а с другой — избежать образования циклов. Поэтому сумма соответствующих членов для деревьев, содержащих маршрут Е -*~ ЕА ЕАВ, должна иметь в качестве сомножителя сложный член (ft_2 + k+4a). Поскольку каждое дерево обязательно содержит также ветви, идущие к ЕР и EQ, рассуждая так же, как и раньше, получаем, что указанная сумма должна иметь в качестве сомножителей (k^q + А;^) и (к^р + &+7). Следовательно, для учета всех восьми деревьев, содержащих маршрут Е ->- ЕА ->- ЕАВ, мы можем записать единый член k+1k+3ab(k_2 + A;+4a)(A;_eg+ft+8) X Х(А_бР+А+7). Аналогичным образом исследуются три других маршрута, включающих две ветви. В результате мы получаем, что выражение из 32 членов для концентрации ЕАВ может быть пред-

70

Глава 3

ставлено в ЭВДв суммы четырех членов, содержащих соответствующие сомножители.

Члены выражения для концентрации Е можно получить путем простой