замены соответствующих констант скорости на константы скорости реакций, имеющих противоположное направление. Так, маршрут Е ЕА -v ЕАВ преобразуется в маршрут Е ч- ЕА ч-ч- ЕАВ, и поэтому в первой сумме сомножитель k+1k+sab заменяется на к_гк_3 и т. д.

Получить члены выражения для [ЕА] несколько труднее, поскольку эта форма фермента занимает в основном графе позицию, топологически отличную от позиций, занимаемых формами Е и ЕАВ. Например, если фрагмент Е — ЕВ — ЕАВ связан с ЕА ветвью ЕАВ -»- ЕА, то он представляет собой маршрут Е ->--v ЕВ ->- ЕАВ и характеризуется сомножителем к+Jc^ab. Если же фрагмент Е — ЕВ — ЕАВ связан с ЕА ветвью Е ЕА, он представляет собой маршрут Е ч— ЕВ ч- ЕАВ и характеризуется сомножителем k_Jc_t. Вывод членов выражения для [ЕА], а также для [ЕВ], [ЕР] и [EQ], имеющих аналогичный вид, мы оставляем читателю1 поскольку освоить этот метод вывода уравнения скорости можно, только применяя его на практике, и дальнейшие объяснения, по-видимому, мало что дадут.

Главное достоинство метода, рассмотренного в этом разделе (помимо того что он позволяет вывести уравнение скорости реакции более простым путем), состоит также и в том, что в получаемом с его помощью уравнении скорости отчетливо проявляются повторяющиеся особенности основного графа и его симметрия, что очень полезно с точки зрения выявления ошибок.

3.6. Реакции, имеющие равновесные стадии

Существует ряд механизмов, достаточно важных, чтобы рассмотреть их подробно, ив то же время настолько сложных, что даже методы, описанные выше, приводят к чрезвычайно громоздким уравнениям скорости. В таких случаях для упрощения вывода уравнения приходится вводить ряд допущений. Зачастую хороший результат дает предположение, что для некоторых стадий (например, для стадий протонирования) на протяжении всей реакции выполняются условия равновесия. Эти допущения не всегда справедливы, но в качестве первого приближения они вполне подходят.

Один из таких методов анализа механизмов, в которых отдельные стадии являются равновесными, описал Ча [27]. Этот метод намного проще, чем полный анализ по методу Кинга—Альтмана, поскольку каждая группа форм фермента, находящихся в равновесии, может рассматриваться как единая форма. Допустим, например, что мы'имеем две формы X и Y, находящиеся в равнове-

Как выводить уравнения стационарной скорости

71

сии ([Y]/[X] = К), и что X и третья формал Z, связаны реакцией относительно медленного превращения:

---Y

(Наличие пунктирных линий подчеркивает то обстоятельство, что эта диаграмма отражает не полный механизм, а лишь его часть.) Скорость медленной реакции в прямом направлении равна ft+itX], однако ее можно записать и как fc+1[X]([X] + [Y])/([X] 4- [Y]) = = А+1([Х] 4- [Y])/(l + К). Другими словами, X и Y можно рассматривать как единую форму, концентрация которой равна ([X] 4- [Y]); при этом константа скорости к+1 для распада формы X снижается до величины fc+1/(l + К}, если рассматривать распад объединенной формы. В общем случае любое число форм, находящихся в равновесии, можно рассматривать как единую форму; каждая константа скорости Тс t снижается при этом до величины fikt, где/j — доля реакционноспособныхмолекул в равновесной смеси. Если реакционноспособной является более чем одна форма, то константа скорости в соответствии с правилом 1 разд. 3.4 будет равна сумме уменьшенных значений констант скорости для параллельных реакций. Поэтому если в рассмотренном выше примере Y также распадается с образованием Z или формы, находящейся в равновесии с Z, с константой скорости то константа скорости распада объединенной формы будет равна (fc+1 4- к+2К)/(1 4- К).

Подобный способ упрощения вывода уравнения скорости особенно полезен при анализе рН-зависимости скорости ферментативной реакции (гл. 6) и при анализе механизмов с параллельными путями. В последнем случае удобно рассматривать альтернативные пути как равновесные, а единственно возможные — как медленные стадии. Уравнения, полученные подобным образом, обычно согласуются с экспериментом, однако это не означает, что принятые допущения справедливы. Действительно, Галбински и Клеланд [61], используя метод моделирования с применением ЭВМ, показали, что дополнительные члены, появляющиеся в точном выражении для стационарной скорости, могут'оказаться весьма существенными. Тем не менее эти члены невозможно выявить, поскольку в любых приемлемых экспериментальных условиях они примерно пропорциональны другим членам уравнения.

72

Глава 3

3.7. Анализ механизмов по внешнему виду графа

Рассмотренный в разд. 3.5 метод представления графов в более компактной форме является ярким примером использования свойств графа при анализе различных механизмов. Исследователю, в совершенстве владеющему методом Кинга — Альтмана, зачастую достаточно просто посмотреть на основной граф, чтобы сделать вывод о виде уравнения скорости для данного механизма, не прибегая к детальным выкладкам.

Важным свойством метода Кинга — Альтмана является то, что каждое дерево дает положительный член и что каждый член появляется в знаменателе уравнения скорости. Поскольку отрицательные члены отсутствуют, взаимного уничтожения не происходит, и, следовательно, в уравнение скорости входит каждый член, для которого существует дерево. Единственное исключение из этого правила состоит в том, что иногда числитель и знаменатель содержат общий множитель, на который их можно сократить. Это имеет место только тогда, когда константы скорости связаны между собой, как, например, в механизме, включающем фермент с двумя независимыми и идентичными активными центрами:

ZArtI5 ktis

Р Кг Р 2/г+2

В этом случае константы скорости для первого и второго центров совпадают (если не учитывать статистические факторы) и уравнение скорости имеет следующий вид:

4&+1 к+а «„я (к_х + к+а) + 4&+1 к+а е0 s2 V ~ 2 (Л_й + &+2)" + 4&+1s + к+а) + 2k2+l s* '

Это уравнение содержит члены с sa, однако, поскольку на самом деле числитель и знаменатель имеют общий множитель 2(fc_x + + к+й + k+1s), оно упрощается до уравнения Михаэлиса — Ментен

У__2fe+2 е0 s_

[к_\ + к+а \

Можно с уверенностью сказать, что для механизмов, в которых между константами скорости не существует никаких других соотношений, кроме тех, которые вытекают из законов термодинамики,

Как выводить уравнения стационарной скорости

73

числитель и знаменатель не имеют общего множителя, поэтому каждый член, для которого существует дерево, должен присутствовать в уравнении скорости. Рассмотрим, например, общий механизм действия модификатора, предложенный Боттсом и Морале-сом [16]:

S

Р

Для того чтобы убедиться в том, что уравнение скорости для этого механизма содержит члены, включающие s2, совсем не обязательно выводить соответствующее уравнение. Достаточно обратить внимание на то, что имеются два дерева, обусловливающих появление этих членов:

Анализ внешнего вида графа, помимо той подьзы, какую он приносит при рассмотрении конкретных механизмов, позволяет сделать важные и далеко идущие выводы о механизмах вообще. Рассмотрим какой-либо механизм (он может быть очень сложным), который содержит следующий сегмент:

Здесь X, Y и Z — три формы фермента. Уравнение скорости будет содержать члены с Jcyx, kyz и члены, в которых обе константы отсутствуют, и не будет содержать членов, включающих обе коне-

74

Глава 3

танты (т. е. произведение kyJcyz). Заменим теперь Y смесью взаимно превращающихся форм Yx и Y2:

Как это повлияет на вид уравнения скорости? Прежде всего, любое произведение из первоначального уравнения войдет и в новое уравнение, добавятся только сомножители &12 или Л21, поэтому никакие комбинации концентраций реагентов не исчезнут. Однако, помимо этого, появятся произведения, которые не содержат ни к12, ни /с21, но содержат как кух, так и куг. Если каждая из констант кух и куг является простой константой скорости первого порядка, то вид уравнения не изменится. Если же обе константы связаны с концентрациями реагентов (например, куга и кугЪ), то при модификации механизма в уравнении скорости появятся ранее отсутствовавшие члены, содержащие ab. Все изложенное позволяет сделать важный вывод: введение стадии изомеризации не влияет на форму уравнения скорости, если ни один из изомеров не способен связывать реагенты. Этот вывод означает, что, измеряя стационарные скорости, нельзя обнаружить многие типы изомеризации (для этого можно использовать предстационарную кинетику; см. гл. 9) и что константы скорости, входящие в уравнение скорости, на самом деле могут представлять собой комбинации констант для нескольких элементарных стадий механизма. Как и для «правила большого пальца», полезно различать изомеризацию свободного фермента, которую в принципе все-таки можно выявить на основе исследования стационарной кинетики, и изомеризацию промежуточных комплексов, обычно в стационарной кинетике не проявляющуюся. На самом деле все эти рассуждения представляют, по-видимому, чисто академический интерес, поскольку стадию изомеризации (будь то изомеризация свободного фермента или изомеризация других форм) никогда не удается надежно идентифицировать на основании измерения стационарных скоростей реакции. Действительно, по крайней мере в одном случае было показано, что изомеризация, которую можно было зарегистрировать другими методами, в измерениях стационарной скорости не выявлялась. Этот случай будет рассмотрен далее, в разд. 5.10.

Обратимые стадии в механизме нельзя рассматривать как равновесные, поскольку наличие в какой-то стадии результирующего потока должно приводить к нарушению равновесия для других стадий. Однако в тупиковой реакции (dead-end reaction), т. е. в

Как выводить уравнения стационарной скорости

75

реакции, присоединенной к остальной части механизма только с одного конца, результирующий поток отсутствует, и поэтому нет оснований 'считать, что равновесие не сможет поддерживаться. Рассмотрим, например, механизм, приведенный в разд. 3.3, добавив к нему стадию образования тупикового комплекса EBQ:

EBQ

ЕАВ EPQ

Для каждой формы, за исключением EBQ