оры

81

Следует особо подчеркнуть, что отношение VI Км приводится здесь потому, что, как правило (хотя и не в данном случае), его проще исследовать; чем параметр Км ¦

4.3. Смешанное ингибирование

При самом элементарном рассмотрении процесса ингибирования ограничиваются обсуждением двух типов ингибирования: конкурентного и неконкурентного. Конкурентное ингибирование действительно распространено очень широко, в то время как случаи неконкурентного ингибирования довольно редки, и рассматривать их здесь детально нет необходимости. Понятие неконкурентного ингибирования возникло в связи с тем, что самые первые исследователи явления ингибирования, Михаэлис и его сотрудники, допускали, что определенные ингибиторы действуют && активность фермента, снижая кажущееся значение V, но не оказывая влияния на параметр Км • Этот тип ингибирования должен был представлять собой случай, альтернативный конкурентному"инги-бированию, и был назван неконкурентным ингибированием. Однако реально представить себе такую ситуацию довольно труд-1 но. Действительно, нужно предположить, что ингибитор снижает каталитическую эффективность фермента, но не оказывает влияния на связывание субстрата. Это допущение, по-видимому, спра-1 ведливо лишь для ингибиторов очень малых размеров, например для протонов и ионов металлов, однако в других случаях подобная ситуация вряд ли может иметь место. Неконкурентное ингибирование или активация протонами — ив самом деле явление распространенное; известно несколько случаев неконкурентного ингибирования ионами тяжелых металлов. Однако неконкурентный характер ингибирования для веществ иной природы наблюдается крайне редко, и для наиболее часто цитированных в литературе примеров — ингибирования инвертазы а-глюкозой [118] и ингибирования аргиназы различными соединениями [81] — после повторения опытов оказалось, что имеет место смешанный тип ингибирования. В общем лучше всего рассматривать неконкурентное ингибирование как особый (и не очень интересный) случай сме^ шанного ингибирования. Его мы и обсудим ниже.

Смешанное ингибирование наблюдается тогда, когда при варьировании концентрации ингибитора происходит изменение как величины VKa№, так и величины Укяук/Км.каж- В простейшем случае выполняются следующие соотношения:

^ каж =-г , (4.2)

каж 1 + i/Kt

4—282

82

Глава 4

V каж/

К

М. каж

Км (1 + i/Ki) 1 + HK't V/Км

(4.3)

(4.4)

М, каж

i + i/Kt '

Этот тип ингибирования укладывается в схему Боттса — Мора-леса, если форма EIS не распадается с образованием продуктов и если все реакции связывания можно рассматривать как равновесные. В этом случае К t есть константа диссоциации для комплекса EI, К i — константа, диссоциации для процесса высвобождения ингибитора из комплекса EIS и Км — константа диссоциации для комплекса ES, т. е. Ks ¦ На самом деле отклонения от этих уравнений, наблюдаемые в тех случаях, когда реакции связывания не являются истинно равновесными, обычно очень малы, и поэтому - выполнимость уравнений (4.2) — (4.4) нельзя рассматривать как доказательство того, что Км, К t и К t' являются истинными константами диссоциации.

Смешанное ингибирование — это чаще всего особый случай ингибирования продуктом. Если отщепление продукта происходит на стадии, приводящей к образованию формы свободного фермента, отличающейся от исходной формы, которая связывает субстрат, то следует ожидать ингибирования продуктом, описываемого уравнениями (4.2) —(4.4). Этот вывод не зависит от того, делаются ли какие-либо допущения о существовании равновесных процессов, и прямо следует из допущения стационарности, как это можно было видеть при изложении методов 'вывода уравнения стационарной скорости в гл. 3. Простейшим механизмом подобного типа является механизм, в котором продукт высвобождается на второй из трех стадий:

Примеры механизмов усложненного типа можно найти в большом количестве среди реакций, протекающих с участием более одного субстрата или продукта (гл. 5). В этих случаях константы Kt и К t нельзя рассматривать как константы диссоциации. Даже в разобранном выше простом случае К г и К t' выражаются следующим образом: К, = (к_г + k+2)kjkjt_2 и Кt' = (/с+2 + к+3)/к_2, т. е. ни одна из констант не является константой равновесия, за исключением особых случаев, когда А+3 « А+2. Если к_г = = т° &i; равна Kt', и уравнение (4.3) сводится к /?м,каж =

Ингибиторы и активаторы

83

= Км- Этот случай, очевидно, соответствует неконкурентному ин-гибированию. Однако для равенства между собой k_t и к+3 нет никаких серьезных оснований, и, следовательно, нельзя считать, что в этом случае ингибирования продуктом (или в любом другом) будет наблюдаться неконкурентное ингибирование.

Ввиду того что неконкурентное ингибирование встречается очень редко, некоторые энзимологи трактуют термин «неконкурентное ингибирование» более широко, включая в него случай смешанного ингибирования. Подобное нововведение не дает никаких преимуществ и является весьма неудачным, поскольку вносит еще большую неопределенность в и без того запутанную ситуацию. Для того чтобы избежать этой неопределенности, в тех редких случаях, когда хотят отметить, что имеет место именно неконкурентное ингибирование, приходится называть его чисто неконкурентным.

4.4. Бесконкурентное ингибирование

Последний из простых типов ингибирования, который следует обсудить, получил в литературе неудачное название бесконкурентное ингибирование; для него характерно то, что V и Км изменяются в одинаковой степени, и поэтому отношение VIКм остается неизменным:

V

Укаж = 7TW' к = Км

Сопоставление этих уравнений с уравнениями (4.2)—(4.4) пока-зывает,что бесконкурентное ингибирование является предельным случаем смешанного, когда К t стремится к бесконечности. Таким образом, бесконкурентное ингибирование является прямой противоположностью конкурентному, поскольку последнее является другим предельным случаем смешанного ингибирования, когда К i стремится к бесконечности.

Бесконкурентное ингибирование можно описать с помощью схемы Боттса—Моралеса, если допустить, что образование формы EI не происходит вообще, а форму EIS рассматривать как «тупиковый» комплекс. Это означает, что центр, связывающий ингибитор, становится доступным для ингибитора только после того, как свяжется субстрат. К такой модели мог бы привести механизм индуцированного соответствия (см. разд. 7.6), и она, по-видимому, 4*

84

Глава 4

лучше всего объясняет случай бесконкурентного ингибирования щелочной фосфатазы L-фенилаланином [59]. В других случаях ингибитор может связываться с центром, который становится доступным после высвобождения одного из продуктов, как это имеет место для механизма, названного механизмом с замещением фермента (см. разд. 5.2):

А

ЕА Е'Р

EQ Е'В

Т

В этом механизме «тупиковый» ингибитор, связывающийся только с Е', будет бесконкурентным по отношению к одному субстрату, А, в то время как ингибитор, связывающийся только с Е, будет бесконкурентным ингибитором по отношению к другому субстрату, В.

Бесконкурентное ингибирование чаще всего встречается как случай ингибирования продуктом, в особенности для реакций, включающих три или более продуктов (разд. 5.8). В общем случае продукт выступает в роли бесконкурентного ингибитора, если отсутствуют обратимые стадии между формой фермента, с которой связывается этот продукт, и формой фермента, с которой связывается субстрат.

4.5. Графическое представление результатов ингибирования

Все типы ингибирования, которые были рассмотрены в трех предыдущих разделах, являются примерами линейного ингибирования. Это название предложено в связи с тем, что для всех рассмотренных типов ингибирования между величинами 1/^каж и Кгл.каж/Vкаж и концентрацией ингибитора существуют простые линейные зависимости. Линейное ингибирование называют иногда также полным ингибированием, поскольку при достаточно больших концентрациях ингибитора скорость ферментативной реакции приближается к нулю. Как мы увидим далее (разд. 4.7), возможны и другие типы ингибирования, однако здесь мы ограничимся рассмотрением линейного ингибирования.

Ингибиторы и активаторы 85

СВОЙСТВА ЛИНЕЙНЫХ ИНГИБИТОРОВ Таблица 4.1

Тип ингибироваввя V каж "каж/^М, каж ^М, каж

Конкурентное V 1 + i/Kt KM{i+i/Kt)-

Сметанное V

1 + цк\ - 1 + UKi

Бесконкурентное V

1 + «7<^

Свойства линейных ингибиторов суммированы в табл. 4.1. Из этой таблицы видно, что изменения величин Укаж и ^каж^м.каж в присутствии ингибиторов Подчиняются простым закономерностям и легко запоминаются. Напротив, изменения величины !?м,каж сложны и запутанны. Поэтому в целях запоминания лучше рассматривать величину ^м,каж не КаК самостоятельный параметр, а как отношение величин FKaiK и Киаж//?м,каж- Ддя установления типа ингибирования может быть использован любой из графиков, представленных в разд. 2.5, поскольку все они позволяют оценить кажущиеся значения кинетических параметров. Например, если построены зависимости s/v от s при различных значениях i, то при наличии конкурентной составляющей в эффекте ингибирования варьирование i приводит к изменению величины отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат {KKiKUJK/VKam), а при наличии бесконкурентной составляющей — к изменению наклона (HVKax). С другой стороны, если построены прямые, отображающие зависимость УКаж от Км,каж» то смещение точки пересечения характеризует тип ингибирования: для конкурентного ингибирования точка пересечения смещается вправо, для бесконкурентного она смещается по направлению к началу координат, а для смешанного ингибирования характер смещения точки пересечения промежуточный. Все описанные графики представлены на рис. 4.1.

Для определения действительных значений К { и К i требуются графики иного рода. Простейший подход здесь состоит в определении кажущихся кинетических констант при нескольких значениях i И ПОСТроеНИИ rpa^HKOB заВИСИМОСТИ ^м.каж/^каж и l/VKam

от i. В каждом случае соответствующая зависимость является линейной, причем отрезок, отсекаемый на оси i, равен —