Kt для

ЗаВИСИМОСТИ ЛГмкаж/^каж От?"И —К i ДЛЯ ЗаВИСИМОСТИ l/Vjtam

от i. Может показаться, что естественнее определять К% путем построения графика зависимости от i величины

86

Глава 4

0 Лм.каж 0 Л'м.каж

Рис. 4.1. Смещение точки пересечения~прямых, построенных в координатах {¦^М каж> ^каж} (см- рис. 2.7) дляТразличных типов ингибирования.

^м.каж. а не. А^м.каж/^каж» однако это нецелесообразно по следующим двум причинам. Во-первых, зависимость Км, каж от i является линейной только в случае конкурентного ингибирования; если ингибирование смешанное, то указанная зависимость отклоняется от линейности. Во-вторых, зависимость #м,Каж от г является менее точной (даже в случае конкурентного ингибирования), поскольку величину #м,каж никогда нельзя определить с

такой же ТОЧНОСТЬЮ, Как И ВеЛИЧИНу Км,каж/^каж-

Другой широко применяемый в настоящее время метод определения К t предложен Диксоном [44]. Если полное уравнение для смешанного ингибирования

Vs

v = ----п (4.5)

представить в перевернутой форме, то мы получим соотношение

_J_ = (^м + «) (KjKi + s/K'i)i _

v Vs Vs

Зависимость i/v от? графически изображается прямой. Если построены две подобные зависимости при различных значениях s, то абсциссу точки пересечения можно найти, приравняв два выра-

Ингибиторы и активаторы

87

жения для l/v. Нетрудно показать, что прямые пересекаются в точке, где i = —К t. Этот метод позволяет найти Kt для любоге линейного типа ингибирования. В случае бесконкурентного типа ингибирования константа К% равна бесконечности, и поэтому зависимости Hv от i представляют собой серию параллельных прямых.

Следует отметить, что график Диксона не позволяет определить А Б

Рис. 4.2. Определение константы Kt из графиков зависимости l/v от «', построенных при различных значениях s (А), и константы Ki из графиков зависимости s'lv от «', построенных при различных значениях s (Б). В с лучае смешанного ингибирования точка пересечения может быть выше оси абсцисс для первого графика и ниже оси абсцисс для второго графика или наоборот; если к.1 - (чистое неконкурентное ингибирование), то пля обоих графиков точка пересечения лежит на оси абсцисс.

88

Глава 4

константу бесконкурентного ингибирования К t'. Эту константу можно найти, построив зависимости s/v от i для ряда значений ? [35]. Мы получим серию прямых, пересекающихся в точке с абсциссой i = —К t'f Оба типа графиков представлены на рис. 4.2.

Чтобы найти Kt и К{ из одного графика, можно в принципе воспользоваться графическим методом Хантера и Даунса [81]. Для этого нужно при каждой концентрации субстрата знать наряду со скоростью реакции в присутствии ингибитора vt скорость реакции в его отсутствие v0; эта задача обычно легко решается на практике. Если в уравнении (3.5) записать vt вместо v, с одной стороны, и v0 вместо Vs/(Km -f- s) — с другой, то после преобразования получим

*M + S (4.6)

Щ — vt " KjKi+slK'i В случае конкурентного ингибирования (К t упрощается:

foe

-оо) это уравнение

¦=Kt(i+s/KM)

Следовательно, зависимость ivt/(v0—от s представляет собой прямую, точка пересечения которой с осью ординат равна Kt. В случае смешанного ингибирования зависимость ivt/(v0— vt) от s, согласно уранению (4.6), графически представляется равнобочной гиперболой, причем отрезок, отсекаемый на оси ординат экстраполированным участком- кривой, по-прежнему равен К t. При

б

к-

IVj

v..

Рис. 4.3. Определение обеих констант ингибирования (Й"( и АУ) при помощи одного графика —» зависимости ivil(y0 — v{) от s.

A. Kj <-K.'i (преимущественно ковкурентвое ингибирование). Б. К^>к'^ (преимущественно бесконкурентное ингибирование). В каждо олучае 8авиоимость ivj/(o, — v^) от s изображена пунктиром, за исключением области значений s от 0,2 до 2Км- Это сделано

г

с тем. чтобы подчеркнуть то обстоятельство, что если константы и к{ не являются

величинами одного порядка, то одновременное, определение обеих констант из-за слишком далекой экстраполяции весьма ненадежно.

Ингибиторы и активаторы

89

возрастании s величина iVi/(v0 — Vi) неТрастет до бесконечности, а стремится к предельному значению, равному Kt' (рис. 4.3.). На практике определить одновременно с достаточной точностью отсекаемый отрезок и асимптоту довольно трудно. Однако если величина Км известна, то можно легко рассчитать ту константу ингибирования, которая определяется с меньшей точностью, воспользовавшись тем, что при s = Км величина iv il(v0— v j) равна 2l{ilK i 4- ПК/), т. е. среднему гармоническому величин Kt й К[. С другой стороны, если строить зависимость величины iv tl(v0 — v i) не от 1/s, а от s, то отсекаемый на оси ординат отре-' зок будет равен К(.

Следует отметить, что правая часть уравнения (4.6) не содержит концентрации ингибитора. Это приводит к тому, что скорости реакции могут быть измерены для случайной подборки значений i и s, однако при этом все экспериментальные точки в координатах {iVi/(v0 — vt); s] должны лежать на одной кривой. Таким образом, подобный график удобен для обработки данных, которые не могут быть представлены никаким иным путем. На первый взгляд может показаться, что это не дает никаких особых преимуществ. Однако в отличие от всех других графиков использование зависимости iVj/ivg — 1>;) от s позволяет проводить исследования в гораздо большем интервале значений ins при ограниченном числе измерений. Это обстоятельство может быть полезным в тех случаях, когда из-за экспериментальных трудностей удается поставить только несколько опытов.

Все графики, рассмотренные в этом разделе, весьма полезны для обработки данных по ингибированию, однако они не могут заменить расчетов, если необходимо точно определить константы ингибирования. Всякий раз, когда определяют кинетические константы графическим методом, возникают задачи по статической обработке результатов измерений, столь же^важные при графическом анализе данных ингибирования, как и в более простых, всесторонне исследованных случаях.

4.6. Качественный подход к линейному ингибированию

Для любого механизма наиболее надежный' путь выяснения вопроса о том, какие из кинетических параметров изменяются под действием ингибитора, состоит в выводе соответствующего уравнения скорости и всестороннем его анализе. Однако не менее полезным при решении этой задачи оказывается качественный подход. Для того чтобы убедиться в этом, полезно вникнуть в смысл параметров Км, Vu VIКм- Константа Км первоначально использовалась как мера прочности связывания субстрата ферментом. Хотя подобная интерпретация параметра Км должна применяться с большой осторожностью, в нашем случае она вполне оправданна. Инги-

90

Глава 4

битор, связывающийся с тем же самым центром молекулы фермента, что и субстрат, должен, очевидно, снижать способность фермента связывать субстрат и поэтому увеличивать Кщ<каш. Если ингибитор не оказывает никакого другого действия, то он не будет изменять реакционную способность образующихся молекул ES и, следовательно, не будет влиять на Vкаш- Термин «конкурентный» для этого типа ингибитора является, очевидно, вполне обоснованным. В известном смысле это обстоятельство сыграло неблагоприятную роль, потому что если бы не оно, то не имеющие физического смысла термины «неконкурентный» и «бесконкурентный» вряд ли вошли бы в научную литературу. Лучше всего рассматривать Эти два термина просто как «ярлыки» и не пытаться искать связи между названием и сущностью явления.

Параметр V характеризует предельную скорость ферментативной реакции, соответствующую случаю, когда весь фермент полностью переходит в форму ES. Любой ингибитор, который препятствует распаду комплекса ES на продукты, связываясь с одним из промежуточных соединений с образованием «тупикового» комплекса или вызывая обращение одной из стадий в соответствии с законом действующих масс, должен снижать величину VKam. При подобном характере действия ингибитора относительные количества свободного фермента и комплекса ES будут, как правило, снижаться, что приведет также к изменению величины Км,каж- Таким образом, можно ожидать, что любое соединение, препятствующее распаду комплекса ES на продукты, будет выступать в роли смешанного ингибитора.

Параметр VIКм часто рассматривается просто как некая производная величина (а именно как отношение V к Км)> однако он имеет вполне определенный физический смысл: VIKm — это константа скорости псевдопервого порядка для реакции

E + S--> Е + Р.

К этой простой схеме сводится механизм Михаэлиса — Ментен, если концентрация комплекса ES неизмеримо мала по сравнению с концентрацией свободного фермента, т. е. при очень низких концентрациях субстрата. В этих условиях система находится вдали от насыщения, поскольку то небольшое число комплексов ES, которое образуется, существует столь короткий промежуток времени, что не может заметно снизить концентрацию свободного фер-мента и, следовательно, существенно повлиять на вероятность столкновения между молекулами свободного фермента и субстрата . По этой причине зависимость v от s при достаточно малых кон-центрациях субстрата (s <С 0,1 Км) аппроксимируется прямой с наклоном, равным VIKm- Если говорить об ингибировании, то эта аппроксимация особенно важна для бесконкурентных ингибиторов, Характерной особенностью которых является отсутствие влияния

Ингибиторы и активаторы

91

на величину ^квж/Лм,каж- Из проведенного анализа ясно следует^ что бесконкурентные ингибиторы характеризуются ничтожно малым влиянием на скорость ферментативной реакции при очень низких концентрациях комплекса ES. Если ясно осознавать это, то при рассмотрении какого-либо конкретного механизма нетрудно понять причину возникновения бесконкурентного ингибирования. Как видно из предыдущего раздела, существует два механизма этого процесса. В одном из них ингибитор присоединяется исключительно к комплексу ES или к другому промежуточному соединению, но не способен связываться со свободным ферментом. Однако при очень низких концентрациях субстрата свободный фермент является единственной формой фермента, присутст