вующей в ощутимой концентрации, и поэтому ингибитор, способный присоединяться только к другим формам, не может оказывать никакого влияния на скорость реакции. Второй (и более важный) случай бесконкурентного ингибирования — зто ингибирование продуктом для механизмов, в которых обратимые стадии связывания субстрата и высвобождения продукта (они обозначены на приводимой ниже схеме как <->) отделены друг от друга с обеих сторон необратимыми стадиями (обозначенными как -»-), т. е.

А

В этом механизме продукт Р может оказывать ингибирующее действие только путем присоединения к форме EQ. Подобное ингибирование возможно при высоких концентрациях А, когда одна из стадий высвобождения продукта является лимитирующей, однако оно отсутствует при низких концентрациях А, когда лимитирующей становится стадия Е + А-> ЕА и Е является практически единственной формой фермента. Таким образом, в данном случае Р выступает в роли бесконкурентного ингибитора, поскольку он оказывает ингибирующее действие только при высоких концентрациях А. Отдельные стадии ферментативного механизма могут стать необратимыми либо в том случае, когда субстрат присутствует в насыщающей концентрации (например, В в рассмотренном примере), либо когда концентрация продукта равна нулю (например, продукт Q в начальный момент времени).

92

Глава 4

4.7. Гиперболическое ингибирование и активация

Большинство изученных ингибиторов рассматривается как линейные, хотя, по-видимому, исключений из этого положения гораздо больше, чем можно было ожидать. Основанием для таких сомнений может служить то, что схема Боттса — Моралеса вполне реальна и из нее следует, что в общем случае (за исключением узкой области значений кинетических параметров) ингибирование не должно быть линейным. Пользуясь полной схемой Боттса— Моралеса, удобно рассматривать ингибирование и активацию вместе, поскольку различие между ними носит скорее количественный, чем качественный характер, и для обоих случаев справедливы одни й те же алгебраические соотношения. Для обозначения любого модификатора (будь то ингибитор или активатор) будет использоваться символ X. Тогда если все стадии связывания в ферментативной реакции рассматривать как равновесные и обозначить константы диссоциации так, как это показано на приведенной ниже схеме,

^кат

>Е+Р

EXS

-ЕХ+Р

то уравнение скорости примет следующий вид:

v =

(feKaT + k'Kar х/К'х ) e0s

(4.7)

На самом деле это уравнение применимо даже в том'случаё, когда стадии связывания в стационарном состоянии нельзя считать равновесными, потому что наблюдаемые в этом случае отклонения обычно слишком малы, чтобы их можно было обнаружить. Следог вательно, параметры Кщ, Кх и К' х нельзя интерпретировать как константы равновесия, хотя при выводе уравнения предполагалось, что они являются таковыми.

Уравнение (4.7) по форме совпадает с уравнением .Михаэлиса—

Ингибиторы и активаторы

93

Ментен, если учесть, что

каж

(&кат+ Кгпх1К'х)ео 1 + х1К'х

(4.8)

М, каж

Км{\+х/Кх) 1 + */Кх

(4.9)

(*кат + ^Кат

Км (1 + х/Кх)

(4.10)

Если А'кат > Акат, то VKaJK растет с увеличением а;. Поэтому при достаточно больших s, когда v —»- УКаж> X является активатором, если А'кат> Акат, но ингибитором, если /е'ках <С Акат. При достаточно малых значениях s, когда и -*- ^кажв/.ЙГм>каж» X оказывает влияние на скорость реакции в соответствии с уравнением (4.10). В этом случае, если k'KCLT/K'х;> > кк&т/Кх, ^каж/^м.каж растет с увеличением х. Поэтому данный модификатор может выступать в роли ингибитора при низких значениях хин роли активатора при высоких. При k'KCLJK'х <; < kKCLJKx наблюдается обратная картина. Таким образом, при использовании полной схемы Боттса — Моралеса граница между активаторами и ингибиторами становится весьма размытой.

Уравнения (4.8) —(4.10) имеют сходную структуру, и в каждом случае при построении зависимости левой части каждого'уравне-ния от ж или 1/х получается равнобочная гипербола, которая не проходит через начало координат. Преобразовать эти зависимости так, чтобы графически они представлялись прямыми, невозможно, поскольку, каждая из них включает три независимые константы. Однако для приблизительного анализа кривых можно восполь^-зоваться графическим методом, примененным ранее при анализе кривой такой же формы (рис. 4.3), хотя для получения более надежных результатов лучше воспользоваться статистическими ме^-тодами (см. гл. 10). В связи с тем что зависимости параметров ^каж» Дм.каж и ^каж/^м,каж °т х являются гиперболическими, модификаторы, действие которых описывается полной схемой Боттса — Моралеса, часто называют гиперболическими активаторами или ингибиторами. Некоторые исследователи используют термин частичное ингибирование (partial inhibition), чтобы подчеркнуть то обстоятельство, что ферментативная активность при насыщенной концентрации ингибитора полностью не подавляется.

Рассмотрим теперь некоторые специальные случаи. Если &'кат = = 0, то уравнения (4.8) — (4.10) переходят в уравнения, хаь рактерные для линейного смешанного ингибирования (разд. 4.4). Если /е'кат = &кат, то мы получаем гиперболическую конкурентную активацию или ингибирование. В этом случае термин «кон-

94

Глава 4

курентный» оказывается, конечно, неудачным, поскольку S и/Х' могут связываться одновременно молекулой фермента и поэтрму вряд ли конкурируют друг с другом. Появление зтого термина связано с тем обстоятельством, что уравнение (4.8) сводится к уравнению VK&m; — кКЛГе0 = V, которое выполняется в случае линейного конкурентного ингибирования. Гиперболические конкурентное ингибирование можно отличить от линейного, воспользовавшись тем, что в первом случае величина Укажем, каж ПРИ х ->оо не уменьшается до нуля, а график зависимости А'м каж'' IV к аж от х представляет собой гиперболу, а не прямую.

Для того чтобы надежно установить гиперболический тип ингибирования, необходимо провести измерения скоростей ферментативной реакции в широком диапазоне значений i. Трудности, с которыми приходится при этом сталкиваться, делают постановку таких экспериментов очень затруднительной. Вероятно, это обстоятельство и послужило основной причиной редкости сообщений о гиперболическом ингибировании. По-видимому, линейные ингибиторы встречаются только в двух распространенных случаях: при ингибировании продуктами реакции (гл. 5) и при ингибировании близкими аналогами субстрата, т. е. соединениями, которые настолько близки по структуре к субстрату, что конкуренция их с субстратом за связывание с одним и тем же центром становится неизбежной. Однако даже близкие аналоги субстрата могут быть гиперболическими ингибиторами (например, при ингибировании алкогольдегидрогеназы метанолом [154]). В этом случае связывающий центр является, по-видимому, достаточно вместительным, чтобы связать одновременно и зтанол, и метанол. Для всех других типов ингибитора (независимо от того, имеют они физиологическое значение или нет) гиперболическое ингибирование следует рассматривать как норму, а линейное — как отклонение от нее (раньше эта точка зрения не была общепринятой).

Часто оказывается, что ферменты, занимающие ключевые позиции в контроле метаболизма, ингибируются или активируются соединениями, не имеющими структурного сходства с субстратами или продуктами метаболических реакций. Во многих случаях имеются надежные доказательства того, что связывающие центры для субстрата и модификатора пространственно разделены. Это явление часто называют аллостерическим ингибированием или активацией, и оно имеет явное сходство с гиперболическим ингибированием или активацией. Однако аллостерические ферменты имеют и другие аномальные кинетические свойства (эти ферменты рассмотрены в гл. 7). Обсуждая вопросы контроля метаболизма, вместо термина «модификатор» часто используют термин «эффектор», желая подчеркнуть то обстоятельство, что действие модификаторов имеет физиологическое значение.

Ингибиторы и активаторы

I

95

4.В. Непродуктивное связывание

^Основные сведения о свойствах ферментов получены при изучении небольшой их группы, а именно внеклеточных гидролитических ферментов — пепсина, лизоцима, рибонуклеазы и в особенности химотрипсина. Эти ферменты обладают рядом общих свойству делающих их исключительно удобными для детального изучения: они могут быть получены в большом количестве, легко кристаллизуются1, стабильны, присутствуют в виде мономеров и могут рассматриваться как односубстратные ферменты, поскольку для каждого из них в роли второго субстрата выступает вода. Однако при интерпретации кинетических данных следует всегда помнить, что указанные ферменты имеют один общий недостаток: исследования их кинетических свойств, как правило, проводятся с более простыми, синтетическими субстратами. Последние являются гораздо менее высокомолекулярными, чем соответствующие им природные субстраты, которые представляют собой полимеры и не могут быть столь же хоройо охарактеризованы, как их синтетические аналоги. Фермент, способный связывать -полимер, вероятно, может связывать малые молекулы несколькими разными способами. Таким образом, наряду с единственным фермент-субстратным комплексом, который распадается с образованием продуктов, могут существовать многочисленные непродуктивные комплексы, не способные к каталитическому распаду. Эта ситуация иллюстрируется на следующей схеме:

SE

1 Заметим, что по современным представлениям способность к кристаллизации-не является надежной гарантией чистоты ферментов; например, хотя как трипсин, так и уреаза уже в течение многих лет доступны в кристаллическом состоянии, оказалось, что чистота этих ферментных препаратов была очень низкой.

96

Глава 4

'Здесь через SE обозначены непродуктивные комплексы. Эта схема аналогична схеме для линейного конкурентного ингибирования (разд. 4.2); единственное отличие состоит в том, что ингибитор заменен на субстрат. Уравнение скорости в случае образования непродуктивных комплексов имеет следующий вид [сравните с-уравнением (4.1)]: /

i> = -Ьа&Е.-. / (4.11)

Будем называть ожидаемыми значениями V и Кк значения, которые и