мели бы эти параметры в условиях, когда образования непродуктивных комплексов не происходит: ^ОЖид = к+2е0 и Дм. ожид = (&-i + K2)/k+i (сравните с константами, скорректированными с учетом ионизации форм фермента; разд. 6.3). В таком случае уравнение (4.11) можно преобразовать к виду

V*

v =

KM + S ГДв

т/ _ _Ущуид

1 + Км, ожид/Ki *

ir- _М,- ожид

М= 1+*М,ожид/К1 ' У = ^ожид/^м. ожид"

Таким образом, для обсуждаемого механизма*строго выполняется уравнение Михаэлиса — Ментен и наблюдаемая кинетика не позволяет ответить на вопрос о том, существует непродуктивное связывание или нет. Однако, как правило, из эксперимента хотят получить именно ожидаемые величины, поскольку они характеризуют основной каталитический путь к образованию продукта. В то же время измеряемые значения V и /Гм меньше ожидаемых на неизвестную величину, оценить которую не представляется возможным. Действительной характеристикой каталитических свойств фермента является только отношение VIKm- С^!'

Для ферментов, обладающих высокой специфичностью, непродуктивное связывание во внимание не принимается. Обусловлено-это тем, что вероятность непродуктивного связывания в этом случае мала. Однако для ферментов с низкой специфичностью, таких, как химотрипсин, сопоставление результатов, полученных с различными субстратами, может иногда выявить наличие непродуктивного связывания. Например, Инглес и Ноулис [83], измеряя скорость гидролиза ряда ацилхимотрипсинов и используя ациль-ные группы с различной реакционной способностью, показали,

Ингибиторы и активаторы

чточз случае производных L-аминокислот скорость гидролиза наиболее высока для аминокислот с большими гидрофобными груп-Нами\ (например, для ацетил-Ь-триптофанилхимотрипсина). Для соответствующих же производных D-аминокислот картина обратная. Полученные результаты проще всего объяснить, если допустить наличие непродуктивного связывания: для ацильных групп с благоприятной для катализа Ь-конфигурацией| большие гидрофобные боковые группы обеспечивают прочное и жесткое связывание, характеризующееся правильной ориентацией, благодаря чему образование непродуктивных комплексов практически исключается. В то же время для ацильных групп с D-конфигурацией прочное и жесткое связывание тех же групп приводит к образованию непродуктивных комплексов.

Непродуктивное связывание при обсуждении вопросов ингибирования ферментов, как правило, не рассматривается; более-того, о нем вообще редко упоминают. Между тем ясно, что непродуктивное связывание является особым случаем конкурентного ингибирования и его необходимо принимать во внимание при интерпретации результатов, полученных с несколькими субстратами для фермента, обладающего низкой специфичностью. Следует отметить, что термин «субстратное ингибирование» обычно используют в применении к бесконкурентному варианту непродуктивного связывания. Субстратному ингибированию посвящен следующий раздел.

4.9. Субстратное ингибирование

В случае некоторых ферментов к фермент-субстратному комплексу ES присоединяется вторая молекула субстрата, в результате чего образуется неактивный комплекс SES. Схема такой реакции имеет следующий вид:

SES

98

Глава 4

Она аналогична схеме бесконкурентного ингибирования (разд. 4.5) и дает следующее уравнение для начальной скорости: У

где V и Км определяются так же, как и ранее, т. е. V = k+ie0 и Км = (k_i -f- k+2)/k+i. Поскольку это уравнение содержит член,

О 2 4 6 810 -1 012345

5 5

Рис. 4.4. Влияние субстратного ингибирования на форму кривых зависимости

V от s и s/v от S.

Для обоих графиков сплошные кривые рассчитаны для /См = 1 и V = 1 при отсутствии субстратного ингибирования, а пунктирные линии — для тех же значении/См и^

включающий s2, оно отличается от уравнения Михаэлиса — Ментен. Вклад члена s2/Ksl становится заметным только при высоких концентрациях субстрата, поэтому, если s достаточно мала, скорости реакции приближаются к значениям, удовлетворяющим уравнению Михаэлиса — Ментен, однако при больших значениях s величина v стремится не к V, а к нулю. Дифференцируя выра*-жение.для v по s и приравнивая dvlds к нулю, можно легко показать, что скорость достигает максимального значения, когда я2 = = КмКsi, причем это максимальное значение не равно V. Зависимость v от у представлена на рис. 4.4. На этом же рисунке приведена зависимость s/v от s, которая является не прямой, а параболой. Если Кsi намного превышает Км (а обычно это так), то зави-

Ингибиторы и активаторы

99

симрсть slv от s при малых значениях s является почти строго линейной и может быть использована, как и обычно, для оценки V и Км.

Еспи концентрации субстрата поддерживаются равными или ниже предполагаемых концентраций его в физиологических условиях, субстратное ингибирование обычно не играет существенной роли; однако при высоких концентрациях субстрата оно может стать весьма значительным. Кроме того, субстратное ингибирование является тем «пробным камнем», который позволяет разграничить возможные механизмы ферментативных реакций (этот вопрос обсуждается в разд. 5.6).

4.10. Ингибиторы, обладающие высоким сродством

В начале этой главы мы разграничили обратимые и необратимые ингибиторы. Хотя это разграничение весьма полезно, оно вызывает возражения с теоретической точки зрения, поскольку при этом подразумевается, что различие носит принципиальный характер. В то же время многие «необратимые» ингибиторы на самом деле являются обратимыми, но характеризуются очень высоким сродством к ферменту. Страус и Гольдштейн [137] показали, что механизм действия ингибиторов с высоким сродством можно понять и без привлечения каких-либо допущений качественного характера. Рассмотрим сначала простейший случай, когда ингибитор связывается ферментом в отсутствие субстрата:

Е + I =PtEI.

«о — у ч — у у

Следует отметить, что при этом не вводится допущения о том, что концентрация свободного ингибитора идентична общей концентрации ингибитора i0. В равновесных условиях концентрация у комплекса EI определяется следующим выражением:

y = (e0-y)(i0-y)/Ki. (4.12)

Это уравнение можно преобразовать в квадратное уравнение относительно у. Однако лучше иметь дело с другой величиной —долей, которую составляет форма фермента, находящаяся в несвязанном состоянии, от общего количества фермента, а = (е0 — — у)/е0, поскольку экспериментально скорее всего удастся измерить именно ее, а не у. Исключив у из уравнения (4.12) и преобразовав полученное выражение, приходим к уравнению

i0 = (l-a)e0+(-i--l}Kt. (4.13)

Это уравнение дает значение ?0 при любом конкретном значении а. Уравнение (4.13) можно представить в виде функциональной

100

Глава 4

зависимости ее от i0, однако последняя является менее удобной. Уравнение (4.13) упрощается в двух предельных случаях. Бели *о « Kt, то

*° = (~ ~ О Ki' ИЛИ а = ПТпГ '• \ а I 1 + 'о/Кг

.•если е0» то

. i0 = (1 — а) е0, или а = 1 — i0/e„. (4.15)

Таким образом, вид функции насыщения фермента лигандом зависит от концентрации фермента. Страус и Гольдштейн выделили

eQ=\QO0Ki

1 2

Рис.'Ч.б. Зависимость доли формы фермента, находящейся в несвязанном состоянии (а), от общей концентрации ингибитора ?„ для системы Е + EI, характеризующейся константой равновесия Ki, при различных значениях общей концентрации фермента е0.

три области ингибирования: область А, где применимо уравнение (4.14), область С, где применимо уравнение (4.15), и промежуточную область В, где следует.использовать уравнение (4.13). Ряд кривых связывания представлен на рис. 4.5. Из уравнения (4.14) следует, что при малых значениях е0 (меньших, чем приблизительно 0,1 К i) форма кривой связывания не зависит от величины К t. В экспериментах по изучению стационарных скоростей ферментативных реакций концентрации фермента обычно очень низки (как правило, 10~10—10~7 М). Поэтому при проведении подобных экс-

Ингибиторы и активаторы - 101

периментов заметные отклонения от уравнения (4.14) будут наблюдаться только для ингибиторов, обладающих очень высоким сродством. Однако в живых клетках концентрационные условия «корее всего иные: Срир [135] обнаружил, например, что значения концентраций некоторых важных ферментов в клетке находятся в интервале от Ю-7 до Ю-4 М. Область ингибирования, обозначенная как область А, при физиологических условиях может встречаться поэтому гораздо реже, чем в опытах in vitro, а многие субстраты и ингибиторы in vivo, по-видимому, существуют преимущественно в виде комплексов с ферментами. Высокие концентрации фермента обычно применяются также в опытах по равновесному связыванию и при изучении быстро протекающих стадий ферментативной реакции. В обоих этих случаях допущение о том, что концентрация свободного лиганда (ингибитора или субстрата) и общая концентрация лиганда одинаковы, по-видимому, не выполняется.

Следует отметить, что уравнение (4.13) выведено для равновесных условий при отсутствии в системе субстрата. Если в реакционную смесь внесен субстрат, то кинетические соотношения становятся гораздо более сложными, поскольку для всех ти-йов ингибирования (за исключением чистого неконкурентного ингибирования) добавление субстрата приводит к смещению равновесия между свободным и связанным ингибиторами. В том случае, когда связывание субстрата происходит очень быстро, единственно возможный подход к выяснению механизма действия ингибитора состоит в отыскании полного решения сложных уравнений, описывающих конкурентное ингибирование в области В. К счастью, по крайней мере для некоторых ингибиторов, обладающих высоким сродством к ферменту, высвобождение ингибитора из комплекса EI происходит настолько медленно, что смещением равновесия Е + I *t EI под действием субстрата можно пренебречь. Например, Майерсу [117] удалось описать ингибирование псевдо-холинэстеразы мощным конкурентным ингибитором Nu 683 при помощи уравнения (4.13). Таким образом, низкая скорость взаимодействия фермента с ингибитором привела фактически к тому, что торможение реакции приобрело характер неконкурентного ингибирова