ния. Рассматривая только случай 50 %-ного ингибирования (а = 0,5), Майерс преобразовал уравнение (4.13) к очень простому виду:

,гДе io,5 — значение i0, при котором а равно 0,5. Такой подход, конечно, справедлив только в том случае, если скорость ферментативной реакции измеряется непосредственно после добавления 'субстрата к ферменту, до того как вытеснение ингибитора из комплекса с ферментом станет заметным.

Глава 5

Типы механизмов ферментативного катализа

5.1. Введение

До сих пор мы рассматривали в основном ферментативные реакции, в которых имеется один субстрат и один продукт. В действительности подобные реакции в биохимии встречаются крайне редка; к их числу относятся лишь несколько реакций изомеризации (например, реакция взаимного превращения глюкозо-1-фос-фата и глюкозо-6-фосфата, катализируемая фосфоглюкомутазой). Однако следует иметь в виду, что развитию ферментативной кинетики в значительной степени способствовали два обстоятельства. Во-первых, многие гидролитические ферменты можно обычно рассматривать как односубстратные ферменты, поскольку второй субстрат — вода — всегда присутствует в таком избытке, что ее концентрацию можно считать постоянной. Во-вторых, большинство ферментов в условиях, когда варьируется концентрация только одного субстрата, по своим свойствам очень близки к односубстратным ферментам. Это станет ясно при рассмотрении уравнений скорости реакции, которые будут введены в настоящей главе. Здесь нужно, однако, сделать оговорку, что константа /См для отдельного субстрата имеет в этом случае физический смысл только тогда, когда условия эксперимента строго определены и постоянны (причем оба условия должны выполняться одновременно).

Следует отметить, что механизмы односубстратных реакций совсем не так просты, как может показаться на первый взгляд, потому что из более близких к реальности моделей катализа, учитывающих изомеризацию фермента, следует, что свободный фермент высвобождается при каталитическом распаде фермент-субстратного комплекса в форме, отличающейся от исходной формы, которая связывает субстрат. Поэтому более вероятным является механизм

Е -f S ES *± Е' + Р,

а не простой механизм Михаэлиса — Ментен. Конечную изомеризацию Е' —>¦ Е можно в принципе обнаружить в опытах по ингибированию продуктом реакции. Однако при этом возникают трудности, обусловленные тем, что при исследовании ингиби-

Типы механизмов ферментативного катализа

103

рования продуктом в однопродуктной реакции невозможно предотвратить протекание обратной реакции. Этот вопрос будет рассмотрен далее в разд.5.10.

Существуют три основных кинетических метода установления механизма ферментативной реакции: измерение начальных скоростей в отсутствие продукта, выяснение природы ингибирования продуктами реакции и изотопные исследования с субстратами, содержащими радиоактивные метки. Все методы рассмотрены в настоящей главе на примере двухсубстратной-двухпродуктной реакции

A + B=^P + Q,

Это самый распространенный тип реакций в биохимии: к нему относится около 60% всех известных ферментативных реакций. Существуют более сложные реакции, число субстратов в которых достигает четырех и выше. Однако для их анализа могут быть применены модифицированные соответствующим образом подходы, разработанные для изучения двухсубстратных-двухпродукт-пых реакций.

5.2. Обзор двухсубстратных-двухпродуктных механизмов

Почти все двухсубстратные-двухпродуктные реакции формально представляют собой реакции переноса группы, т. е. реак> -ции, в которых определенная группа (G) переносится от одного радикала, X, к другому, Y:

GX + Y ^ X + GY.

Уонг и Хейнс [150] предположили, что наиболее вероятные пути этого переноса могут быть представлены следующей схемой:

При анализе схемы по методу Кинга—Альтмана требуется учесть 96 деревьев, и получаемое уравнение стационарной ско-

104

Глава 5

.рости чрезвычайно сложно (оно содержит, например, члены, включающие [Y]3). Однако маловероятно, что для каждого отдельного фермента будут иметь место все стадии, указанные на этой схеме, и тот факт, что кинетика действия ряда ферментов все-таки описывается такой сложной схемой, на самом деле является чистой случайностью. Механизмы реакций, катализируемых биотинзависимыми ферментами, например метилмалонил-КоА-карбоксилтрансферазой [121] и пируваткарбоксилазой [8]г по-видимому, включают большую часть стадий (или даже всо стадии) схемы Уонга—Хейнса. Однако для каждого из ферментов реакция идет в основном по одному пути — через EG — и, кроме того, многие стадии можно рассматривать как равновесные (разд. 3.6). Поэтому наблюдаемые кинетические свойства. этих ферментов намного проще, чем этого можно ожидать исходя из строгого уравнения.

Механизм большинства ферментативных реакций гораздо проще, чем механизм Уонга—Хейнса. Среди этих механизмов; можно выделить две основные группы: для одних реакция протекает с образованием в качестве промежуточного соединения тройного комплекса EGXY (названного тройным в связи с тем, что он содержит три реагента — фермент и оба субстрата), а для других— замещенной формы фермента EG. Ранние исследователи, например Вульф [151,152] и Холдейн [64], предполагали, что реакция должна протекать через промежуточную стадию образования тройного комплекса, который возникает либо из двойного комплекса: EGX, либо из двойного комплекса EY. Иными словами, субстраты могут связываться с ферментом в произвольном порядке, как это показано на рис.5.1. Строгое уравнение стационарной скорости для этого механизма имеет сложный вид и содержит члены, включающие [GX]2 и [Y]2. Однако вклад этих членов в скорость-реакции невелик, и Гулбински и Клеланд [61 ], используя метод; моделирования с применением ЭВМ, показали, что если не брать, маловероятные значения для констант скорости, то получаемые-зависимости скоростей от концентраций субстратов имеют точно такой же вид, как и соответствующие зависимости для случая, когда все стадии, за исключением стадии взаимного превращения EXG-Y и EX -GY, являются равновесными. При этом уравнение-скорости не содержит квадратичных членов, и для простоты мы будет использовать уравнения, выведенные в предположении, что скорость установления равновесий очень велика (речь идет-только о механизмах с неупорядоченным присоединением субстратов). Следует, однако, подчеркнуть, что факт выполнимости подобных уравнений нельзя рассматривать как доказательство быстрого установления равновесия, точно так же как на основании* выполнимости уравнения Михаэлиса—Ментен для большинства ферментов нельзя сделать вывод, что при этом справедливо до-

Типы механизмов ферментативного катализа

105

пущение Михаэлиса и Ментен о равновесном связывании субстрата. Измеряя стационарную скорость, стадию EXG • Y<=t ч±ЕХ -GY обнаружить нельзя (см. разд. 3.7), однако логично включить ее в механизм с неупорядоченным присоединением субстратов, поскольку при выводе уравнения скорости эта стадия формально рассматривается как лимитирующая.

|ю> г| р нм>г]

EXG EGY

XG / Y \ /X \GY

р, q p^>mw] р^дад р g

Е EXGY EX-GY Е

ш Y

XG / \GY /

р W| рсэ q

EY EX

X >ч Y

EXY

Рис. 5.1. Механизм, с образованием тройного комплекса и неупорядоченным присоединением субстратов к ферменту и неупорядоченным высвобождением продуктов для двухсубстратной-двухпродуктной реакции.

Непродуктивный комплекс EXY является, по-видимому, кинетически значимым только при высоких концентрациях как X, так и Y и в простых методах анализа механизма часто не принимается во внимание.

Образование непродуктивного комплекса EXY для механизма с неупорядоченным присоединением субстратов не является обязательным, но о такой возможности не следует забывать, поскольку, если образование промежуточных соединений EY и ЕХ существенно, нет никаких оснований исключать из схемы этот непродуктивный комплекс. Еще один непродуктивный комплекс (не обозначенный на рис.5.1) может образоваться в том случае, если переносимая группа -G не слишком велика по размерам: к возникновению комплекса EXG-GY может привести присоединение GY к EGX или GX к EGY. Однако вероятность образования этого комплекса намного меньше, чем для комплекса EXY.

В настоящее время общепринятой является точка зрения, что многие ферменты нельзя рассматривать как жесткие шаблоны (как это предполагает рис.5.1). Более адекватными являются модели, в которых конформации и фермента, и субстрата при образовании

106

Глава 5

комплекса изменяются в соответствии с гипотезой «индуцированного соответствия» [95—97 ] (см.также разд. 7.6). Следовательно, вполне возможна ситуация, что пока фермент не свяжет один из двух субстратов, у него не будет связывающего центра для другого. В таких случаях реализуется принудительный порядок (compulsory order) связывания субстратов, представ-

Гв-fJ ЕЭС

EXY

Рис. 5.2. Механизм с образованием тройного комплекса и упорядоченным присоединением субстратов к ферменту и упорядоченным отщеплением продуктов для двухсубстратной-двухпродуктной реакции.

Предполагается, что упорядоченный характер связывания субстратов возникает вследствие того, что связывающий центр для второго субстрата формируется только после соответствующего изменения конформацин, вызванного связыванием первого субстрата. Непродуктивный комплекс EXY является, по-видимому, кинетически значимым только при высоких концентрациях как X, так и Y и в простых методах анализа механизма часто не принимается во внимание.

ленный на рис.5.2. На самом деле упорядоченное связывание субстратов совместимо с моделью жесткого шаблона", если второй субстрат так же сильно взаимодействует с первым субстратом, как и с ферментом, но это, как правило, приводит к механизму с неупорядоченным связыванием субстратов, в котором один путь предпочтительнее другого. Если принимать во внимание и субстраты и продукты, то окажется, что возможны четыре различных порядка присоединения субстратов и отщепления продуктов. Однако рассмотрение механизмов с упорядоченным присоединением субстратов с точки зрения гипотезы индуцирова