Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

нного соответствия показывает, что обратная реакция должна быть структурно аналогична прямой и поэтому второй субстрат должен быть структурным аналогом первого. Таким образом, скорее всего

Типы механизмов ферментативного катализа

107

реализуются только два из четырех возможных порядков присоединения субстратов и отщепления продуктов. Это согласуется с экспериментальными данными, и, например, в случае реакций, катализируемых НАД-зависимыми дегидрогеназами, коферменты обычно выступают в роли первого субстрата и второго продукта.

По тем же самым причинам, которые рассматривались при обсуждении механизма с неупорядоченным присоединением субстратов, в механизмах с упорядоченным связыванием субстратов обычно образуется непродуктивный комплекс EXY в результате присоединения X к EY или Y к EX.

На заре развития кинетики мультисубстратных реакций Дудо-ров, Вэркер и Хессид [45], применив метод изотопного обмена, показали, что реакция, катализируемая сахарозо-глюкозилтран-сферазой, включает в качестве промежуточного соединения замещенную форму фермента, а не тройной комплекс. Позднее исследования, проведенные на многочисленных ферментах (включая а-химотрипсин, аминотрансферазы и флавоферменты), показали, что механизм, включающий замещенную форму фермента, распространен так же широко, как и механизм с тройным комплексом. Механизм с замещением фермента предусмотрен схемой Уонга—Хейнса и представлен схематически на рис.5.3. В обычном («классическом») варианте этого механизма образование тройного комплекса невозможно вследствие того, что связывающие центры для X и Y либо совпадают, либо перекрываются. Для амино-

EGX EGX

Y

г-н сьз

Е EG

У V У

EY EGY EG-Y

Рис. 5.3. Механизм с замещением фермента для двухсубстратной-двухпро-

дуктной реакции.

В отличие от механизмов с образованием тройного комплекса (см. рис. 5.1 и 5.2) предполагается, что связывающие центры для X и Y совпадают или перекрываются, непродуктивные комплексы ЕХ и EY являются, по-видимому, кинетически значимыми только при высоких концентрациях X и Y соответственно и в простых методах анализа механизма часто не принимаются во внимание. '

108

Глава 5

трансфераз (основной группы ферментов, действие которых подчиняется этому механизму) все четыре участника реакции обладают структурным сходством. Поэтому естественно ожидать, что связывающие центры для X и Y будут практически идентичными и что вторая половина реакции очень похожа на «перевернутую» первую половину. Например,

Глутамат + Пиридоксалевая форма фермента *t =*?t Промежуточное(ые) соединение ^=

*t а-Кётоглутарат -f- Пиридоксаминовая форма фермента, Оксалоацетат + Пиридоксаминовая форма фермента

Промежуточное(ые) соединение ^± *t Аспартат 4- Пиридоксалевая форма фермента.

Для этого механизма субстраты часто связываются «ошибочной» формой фермента, что приводит к ингибированию высокими концентрациями субстрата (см. разд.5.6). Так бывает практически всегда для Е, X и Y; однако для EG, GX и GY такая ситуация возникает реже, что обусловлено стерическими затруднениями, вызываемыми близостью двух G-rpynn.

Механизм с замещением фермента является одновременно механизмом с упорядоченным присоединением субстратов. Однако это обстоятельство не имеет здесь такого значения, как для механизмов с образованием тройного комплекса, поскольку для механизмов с замещением фермента существует единственно возможный порядок присоединения субстратов и альтернативный вариант с неупорядоченным связыванием субстратов исключен: хотя Е часто может связывать X или Y, образующиеся комплексы не способны к каталитическому распаду с образованием GX или GY. /

Как упоминалось ранее, определенные реакции, катализируемые биотинсодержащими ферментами, в основном следуют механизму с замещением фермента, однако эти реакции нетипичны в том отношении, что связывающие центры для X и Y независимы и наряду с замещенными формами фермента в качестве промежуточных соединений образуются тройные комплексы. В последующих разделах главы (и в литературе) под нормальным вариантом механизма с замещением фермента, если не делается специальных оговорок, подразумевается механизм с перекрывающимися или идентичными связывающими центрами для X и Y.

Для любого из приведенных выше механизмов можно в качестве частного случая рассмотреть такую ситуацию, когда две или больше стадий протекают согласованно, т.е. представляют собой фактически единую стадию. Таким, например, является механизм Дудорова—Бэркера—Хессида, предложенный первоначально для сахарозо-глюкозилтрансферазы [45] и представляющий собой частный случай механизма с замещением фермента:

Типы механизмов ферментативного катализа

109-

Аналогичным образом механизм Теорелла—Чанса, предложенный; первоначально для алкогольдегидрогеназы [142], является частным случаем механизма с образованием тройного комплекса w упорядоченным связыванием субстратов:

EGX

EGY

Хотя первый механизм не включает в качестве промежуточного^ соединения формы EGXY, эта форма появляется в роли переходного состояния, и рассмотренный механизм относится к механизмам с тройным комплексом в такой же степени, как и обычные-типы подобных механизмов.

Механизмы с согласованно протекающими стадиями представляют в основном исторический интерес, поскольку в настоящее время обычно удается выявить не учитывающиеся в этих механизмах промежуточные соединения, однако на их примере удобно-демонстрировать химическую природу двух типов механизмов-ферментативных реакций. В случае механизмов с образованием тройного комплекса на поверхности молекулы фермента протекает прямая реакция между субстратами, поскольку атакующая группа Y замещает уходящую группу X:

Y+EGX

EGY+X

110 Глава 5

Может показаться, что фермент не принимает прямого участия в этом процессе. Однако он, несомненно, выполняет две важные функции: вынуждает субстраты принять конформацию и расположение, благоприятствующие протеканию реакции, и, кроме того, вызывая поляризацию молекул субстратов, делает их более реакционноспособными. Кошланд [93 ] предложил называть обсуждаемый механизм механизмом однотактного замещения (single-displacement reaction). Он отметил, что между реакциями, подчиняющимися подобному механизму, и хорошо известными в органической химии реакциями З/^-замещения (реакциями бимолекулярного нуклеофильного замещения) существует тесная взаимосвязь, и предположил, что реакции однотактного замещения, по-видимому, обычно сопровождаются обращением конфигурации у асимметрического атома.

Механизм с замещением фермента Кошланд назвал механизмом двухтактного замещения, поскольку за первоначальным замещением X атакующей группой В, принадлежащей молекуле фермента, следует замещение В вторым субстратом, Y:

E+GX

¦В

Е+Х

EG+Y

E+GY

Эти реакции аналогичны реакциям в органической химии, в которых проявляются «эффекты соседней группы». Конечным результатом двух обращений конфигурации является восстановление исходной конфигурации у асимметрического атома.

Сохранение конфигурации может иметь место и в реакции однотактного замещения, если атакующая группа приближается с той же стороны, где находится уходящая группа («атака с тыла»). Речь идет о реакциях ?лг?-замещения (реакции внутреннего нуклеофильного замещения). Подобный механизм в органической химии встречается крайне редко (в основном лишь для реакций, протекающих с участием тионилхлорида или фосгена), однако в случае ферментативных реакций он, по-видимому, распространен более широко, поскольку условия, в которых протекает реакция на поверхности молекулы фермента, довольно необычны.

Типы механизмов ферментативного катализа

111

Изучение стереохимии ферментативных реакций является полезным методом исследования их механизмов, дополняющим рассмотренные ниже кинетические методы. Однако совсем не обязательно кинетические методы и методы изучения стереохимии реакции должны давать совпадающие результаты, поскольку в-реакциях однотактного замещения может иметь место сохранение конфигурации (в случае атаки с тыла), а реакции двухтактного замещения могут протекать через стадию образования тройного комплекса, если первая уходящая группа (X) остается связанной ферментом вплоть до второго замещения. Подобная ситуация может реализоваться в том случае, когда группа X остается присоединенной к кислой группе А+ до тех пор, пока основная группа В- не образует ионной связи с А+:

ВГ___*а GX

z_\ ^

Е

в" ха

I_I *7

EX GY

^х>+а в_^

ХА

EGX

Б" \ v EX-GY

EGX

Г

EGX-Y

ха

Предложенное Уонгом и Хейнсом схематическое изображение ' реакций переноса групп с использованием обозначений X, Y и G особенно полезно для качественного обсуждения механизмов, ^проведенного в данном разделе, поскольку оно позволяет наглядно представить каждый выделенный механизм. Однако для количественного описания кинетики действия ферментов подобный подход оказывается непригодным, потому что в нем не проводится четкого разграничения между субстратами и продуктами; кроме-того, этот подход не позволяет обозначить концентрации реагентов простыми символами. Далее в этой главе мы вернемся поэтому к способу представления реагентов при помощи отдельных

букв: А, В, Р, Q____ В механизмах с образованием тройного

комплекса и упорядоченным присоединением субстратов чере» А и Q обозначаются реагенты, которые связываются со свободным ферментом; в механизме с неупорядоченным связыванием субстратов реагенты обозначаются произвольно; в механизмах с замещением фермента принимается, что к Е присоединяются А и Q, а к Е' — ВиР, хотя направление пути, связывающего Е с Е', выбирается произвольно. Эти правила можно легко обобщить на случай реакций, включающих более двух субстратов или продуктов.

112

Глава 5

5.3. Классификация механизмов ферментативных реакций т схематическое их представление

Клеланд 130] предложил следующий способ представления механизмов ферментативных реакций: различные формы фермента записывают ниже горизонтальной линии, а стрелками обозначают присоединение субстратов и отщепление проду

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)