Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

ктов. Так, механизм с образованием тройного комплекса и упорядоченным присоединением субстратов и упорядоченным отщеплением продуктов представляется следующим образом:

А В Р Q

1 I_t t

Е ЕА EAB^EPQ EQ Е

„Для обозначения «неупорядоченных» стадий используют разветвленные линии, как, например, в механизме с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстратов и

.неупорядоченным отщеплением продуктов:

А В Р Q

1_* J_I

ЕА / Ей

t ЕВ f 4 ЕР Г

В A Q Р

Идя вдоль схемы слева направо и придерживаясь указанного направления стрелок, получаем прямую реакцию. Обратной реакции соответствует обратный порядок образования фермент-содержащих комплексов и обратное направление стрелок. Подход Клеланда позволяет представлять механизмы ферментативных реакций в компактной форме и особенно удобен для представления простых механизмов с упорядоченным присоединением субстратов. Однако для механизмов, включающих «неупорядоченные» стадии или стадии взаимодействия с ингибитором, он менее удобен и не позволяет простым путем ввести константы скорости.

Клеланд [30] предложил также общую классификацию кинетических механизмов ферментативных реакций. Прежде всего, все двухсубстратные-двухпродуктные реакции названы <ж-<ж-реакция-ми. Механизм би-<ж-реакций с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстратов назван просто неупорядоченным <ж-би-механизмом (random bi bi mechanism), а механизм с образованием тройного комплекса и упорядочен-

Типы механизмов ферментативного катализа

113

ным связыванием субстратов — упорядоченным би-бм-механизмом (ordered bi bi mechanism). Следует отметить, что если специально не оговорить вопросы, связанные с терминологией, название, которое дано последнему механизму, не позволяет отличить его от механизма с замещением фермента. Поэтому механизм с замещением фермента назван иначе — пинг-понг-би-би-механиз-мом (ping pong bi bi mechanism). Все механизмы, предполагающие, что отщеплению какого-либо продукта должно предшествовать связывание каждого из участвующих в реакции субстратов (в случае двухсубстратных-двухпродуктных реакций это механизмы с образованием тройного комплекса), называют последовательными механизмами (sequential mechanisms). Напротив, механизмы, в которых некоторые продукты освобождаются раньше, чем все субстраты свяжутся молекулой фермента, называют пинг-понг-механизмами (ping pong mechanisms). Дли механизмов, содержащих стадию изомеризации свободного фермента, в название механизма включают приставку изо. Для обозначения числа стадий присоединения субстрата или отщепления продукта в тех случаях, когда может возникнуть неопределенность, используются приставки уни, би, тер и квад.

Подход Клеланда в принцж не применим ко всем сложным механизмам, хотя на практике словесное описание механизма или представление соответствующей кинетической схемы дает более ясную картину. Например, вряд ли такое название механизма, как изо-би-би-уни-уни-пинг-понг воспринимается легче, чем его словесное описание: «трехсубстратный-трехпродуктный механизм, в котором упорядоченное связывание первых двух субстратов сопровождается отщеплением двух продуктов; после этого происходит связывание третьего субстрата, высвобождение третьего продукта и, наконец, изомеризация фермента в исходную форму». В свою очередь кинетическая схема дает более ясное представление об этом механизме, чем любой из первых двух способов.

Б—282

114

Глава 5

5.4. Уравнения скорости

Измерения стационарных скоростей сыграли исключительно важную роль для дифференциации различных механизмов реакций переноса групп. Необходимость разработки методов анализ а кинетических механизмов обусловлена тем, что для подобных реакций существует большое число возможных механизмов, которые относительно мало различаются по кинетическим свойствам. Одними из первых осознали необходимость систематического подхода в исследовании кинетических свойств различных механизмов ферментативных реакций и вывели уравнения скорости для некоторых из них Сигал, Кахмар и Бойер [132 J. Основные успехи в понимании механизмов реакций переноса групп были достигнуты в проведенных позднее исследованиях Альберта [3,4] и Диила1 [40]. Большинство методов, описанных в данной главе, разработано именно этими авторами.

Поскольку все методы дифференциации механизмов, построенные на измерении стационарных скоростей, используют различия в полных уравнениях скорости, целесообразно до обсуждения этих методов кратко рассмотреть уравнения скорости для механизмов различных типов. Уравнение скорости для механизма с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов было выведено в разд. 3.3 в качестве иллюстрации применения метода Кинга—Альтмана. Оно имеет следующий вид:

v = _ e0(Clab — с2рд)_ ^ ^

[c3+cta+cbb+cBp+c7g+caab+ с&р + c10bg + cupq + c12abp + ci3bpq\

Это уравнение содержит тринадцать коэффициентов, которые определяются комбинациями только восьми констант скорости. Следовательно, между коэффициентами должны существовать определенные соотношения, которые, однако, не отражаются в уравнении. Кроме того, коэффициенты не имеют четкого физического смысла. Были предприняты многочисленные попытки представить уравнения скорости в форме, содержащей параметры, имеющие более определенный физический смысл (см., например, [3.12, 30, 40, 108]). Простейшим из подходов с точки зрения понимания и использования является метод Клеланда, слегка видоизмененный в настоящей книге в соответствии с рекомендациями Комиссии по ферментам при Международном биохимическом союзе [84]. Для любого механизма максимальные скорости в прямом и обратном направлениях обозначаются через Vy и Vr соответственно (в достаточно ясных случаях индексы могут быть опущены). Кроме того, для каждого реагента задается константа Михаэлиса

1 Некоторые советские авторы не совсем правильно пишут фамилию этого автора как Дальцил. — Прим. перев.

Типы механизмов ферментативного катализа

115

{Км., Км и т.д.) и «константа ингибирования» (К?» К? и т.д.). Физический смысл этих параметров станет ясен из последующих разделов этой главы, однако в общем константы Михаэлиса соответствуют Км в односубстратной реакции, а константы ингибирования связаны (но не обязательно равны) с Кг и К*' через неличины, которые измеряются в экспериментах по ингибированию продуктами реакции. В определенных условиях константы ингибирования являются истинными константами диссоциации для фермент-субстратных комплексов, и поэтому некоторые исследователи обозначают их через Ks, а не через Ki-

В этой системе обозначений уравнение (5.1) принимает следующий вид:

Vf ab VT pq

Kt Км Км К? /к 0.

v = ->-. (b.Z)

K$ib К$Р Я ab К%ар

Kt KtKM ККК? К? KtK„ KtKKK?

Км bq pq abp bpq

KtKnK? KMK? KfK&K? <*M

Соотношения, связывающие кинетические параметры уравнения (5.2) с константами скорости отдельных стадий, представлены в табл. 5.1.

Соответствующее уравнение для механизма с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстрата имеет следующий вид:

Vf ab Vr pq

v=--^-. (5.3)

a b p q ab pq

&t Kf Kf Kf K?Km ^ KHK?

При выводе этого уравнения предполагается, что все стадии (за исключением стадии взаимного превращения форм ЕАВ и EPQ) равновесны. При сделанном допущении параметры Kt, Kf, К7 и К? представляют собой константы диссоциации комплек-1 сов ЕА, ЕВ, ЕР и EQ соответственно; Кп и Км. —константы диссоциации комплекса ЕАВ для отщепления А и В соответственно; Км и Км — константы диссоциаци и комплекса EPQ для отщепления Р и Q соответственно. [Хотя уравнение (5.3) не содержит параметров Км и Км, их нетрудно ввести, поскольку в обсуждаемом механизме Кн К? можно заменить на К fx 5*

116

Глава 5

Таблица 5.1

СМЫСЛ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ДВУХ ОСНОВНЫХ МЕХАНИЗМОВ С УПОРЯДОЧЕННЫМ ПРИСОЕДИНЕНИЕМ СУБСТРАТОВ

Параметр

Механизм с образованием тройного комплекса

Механизм с замещением комплекса

Аг+1с

А+4 EQ

к^д к.,

к-ър

К\а 1

±ЕА Ё ' * ''

ЕА

:Е'Р

\Кгъ

.ЕАВ "EPQ

EQ Е'Б'

42

лм

Км К? К? Kf К?

fc+S fc+4 gp

4 fc+4 fc_1 fc_2 ^0

fc_l 4 fc_2 fc+3

fc+i (fc+з 4" fc+4)

(fc_2 4 fc+з) fc+4 fc+2 (fc+3 4 fc+4) fc-l (fc-2 4 fc+g)

(fc-l 4 fc_a) fc-з

fc_i fc_2 (fc_i 4 fc_a) fc-4

fc_i/fc+i

(fc_i 4 fc_2)/fc+a (fc+з 4 fc+»)/fc_3

fc+4/fc-4

fc+2 fc+4 go fc+a 4 fc+4 fc-i fc_a eo fc-i 4 fc-s (fc-l 4 fc+8) fc+4

fc+1 (fc+2 4 fc+4)

fc+a (fc-з 4 fc+4)

(fc+2 4 fc+u) fc+3

(fc_i 4 fc+2) fc-з (k_i 4 fc_3) fc-2 fc-i (fc-з 4 fc+4)

(fc-l 4 fc-з) fc_4

fc_l/fc+l

fc-з/fc+з')

fc+г/fc-2 fc+4/fc-4

•) Хотя уравнение (5.4) не содержит параметра К,- . его можно ввести, если воспользоваться равенством Км / *Ч ^М =^>М ^Р-

Х/См, а /С? /См — на #м В уравнении (5.2) подобные замены невозможны, и отчасти по этой причине оно не только содержит дополнительные члены, но и имеет более сложный вид.] Однако, поскольку уравнение (5.3) согласуется с экспериментом в пределах ошибки измерения независимо от того, выполняются ли условия ра вновесия для стадий связывания или нет, в общем случае констан ты Михаэлиса и константы ингибирования нельзя рассматривать как истинные константы диссоциации.

Типы механизмов ферментативного катализа

117

Для механизма с замещением фермента уравнение скорости записывается следующим образом:

Vfab ¦ VTpq

v - -----. (5.4)

а -Км ^ р 9 ab ар

Kb** pq

¦ Kf K&K? + KfKM

Смысл кинетических параметров понятен из табл. 5.1. В форме, записанной через коэффициенты, это уравнение совпадает с уравнением (5.1), за исключением того, что в знаменателе отсутствуют константа и члены, содержащие аЪр и bpg. Однако соотношения между параметрами в уравнении (5.4) иные: всюду, где можно было из сопоставления с уравнением (5.2) ожидать появления параметра К®, оно содержит параметр Kf К%.

Уравнения скорости для вариантов рассмотренных механизмов, содержащих объединенные стадии, похожи, как правило, на исходные уравнения, однако в них

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)