отсутствуют определенные члены. Например, уравнение скорости для механизма Теорелла— Чанса, в котором связывание В и отщепление Р объединены в одну стадию, не содержит члена, включающего произведение концентраций Ъ и р. Поэтому уравнение скорости для этого механизма совпадает по виду с уравнением (5.2), в котором исключены члены, содержащие аЪр и bpq. Если представить обсуждаемый механизм в еще более сжатой форме, добавив к1 объединенной стадии стадию отщепления Q, как это показано ниже, можно сделать интересное предсказание.

В этом случае из знаменателя выражения скорости реакции исчезают все члены, включающие ab, ар, bq, abp и bpq,rn скорость реакции уже не приближается к конечной величине при одновременном увеличении а и Ь: при а —v оои b —v оо v стремится к бесконечности. Подобный механизм выполняется, по-видимому, для ^каталазы [29 ]; скорость ферментативной реакции, катализи-

118

Глава 5

руемой каталазой, при высоких концентрациях обоих субстратов не обнаруживает тенденции к насыщению. Аналогичным свойством обладает и механизм Дудорова—Бэркера—Хессида, однако экспериментальные данные подобного рода отсутствуют.

5.5. Измерение начальной скорости в отсутствие продуктов реакции

Если реакционная смесь не содержит продуктов реакции, то начальная скорость реакции, которая следует механизму с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов, определяется следующим выражением:

v = -. (5.5)

Я/Ям + *ма+Ямь+аЬ

Это уравнение получается из уравнения (5.2) исключением членов, содержащих произведения концентраций. Чтобы выяснить смысл ^параметров V, К?, К% и Км, необходимо проанализировать уравнение (5.5) при крайних значениях а и Ь. Если а шЪ очень велики, то уравнение принимает простой вид: v = V. Следовательно, V — это скорость реакции в условиях, когда концентрации обоих субстратов являются насыщающими; она соответствует, очевидно, максимальной скорости V в одно-субстратной реакции. Если Ъ очень велика, то уравнение (5.5) принимает следующий вид:

Va

v -д- •

Это уравнение совпадает с уравнением Михаэлиса—Ментен. Таким образом, параметр — это предельное значение константы Михаэлиса для реагента А при насыщающих концентрациях реагента В. Аналогичным образом параметр /См представляет собой предельное значение константы Михаэлиса для реагента В при насыщающих концентрациях реагента А. Параметр К* не идентичен параметру Км, и его смысл становится ясным, если рассмотреть уравнение (5.5J в условиях, когда Ъ очень мала (но не равна нулю):

V — —--- .

Следовательно, параметр Kf представляет собой предельное значение константы Михаэлиса для реагента А при Ъ -*¦ 0. Этот

Типы механизмов ферментативного катализа

119

параметр является также истинной константой диссоциации комплекса ЕА, поскольку в условиях, когда о стремится к нулю, скорость взаимодействия В с ЕА также уменьшается до нуля. В этих условиях реакцию связывания А с Е можно рассматривать как равновесную и считать, что выполняется допущение Михаэлиса—Ментен о равновесном связывании.

В уравнение (5.5) не входит параметр /С?, поскольку реагент В не связывается свободным ферментом. Тем не менее измерение начальных скоростей в отсутствие продуктов реакции не позволяет провести различия между реагентами А и В, потому что форма уравнения при взаимной замене реагентов остается неизменной.

Если варьировать концентрацию одного субстрата при фиксированных (но не насыщающих) концентрациях другого, то уравнение (5.5) по-прежнему можно будет представить в форме уравнения Михаэлиса—Ментен. Например, если варьируется а при постоянной Ь, то зависимость у от а имеет с ледующвй вид:

v =

Однако FKaHtH АТм.каж'(кажущиеся значения V и К^) в этом случае

зависят от Ъ: *

Vb

Ркаж^ „в , (5.6)

*М.каж= 1 " М

VvarK Vb *м

• ь

(5.8)

+ Ъ

При проведении эксперимента необходимо выбрать несколько разных значений Ъ и далее при каждом из них измерить скорости при различных значениях а. Затем, точно так же как и в случае одно-субстратной реакции, например, из графика зависимости alv от а (разд. 2.5), при каждом значении 6 можно определить Vvam и ^м»иаж- Подобный график называют первичным в отличие от вторичных графиков, которые будут кратко рассмотрены ниже. Н а

120

Глава 5

рис. 5.4 представлена типичная серия первичных зависимостей a/v от а для ферментативной реакции, описываемой уравнением (5.5). Для механизмов с образованием тройного комплекса характерно то обстоятельство, что первичные линейные зависимости

-к? //Ж

а

Рис. 5.4. Первичные графики зависимости a/v от о при различных фиксированных значениях b для механизмов с образованием тройного комплекса.

Предполагается, что ингибирование избытком субстрата отсутствует. Зависимости b/v от Ь при различных фиксированных значениях а имеют аналогичный вид.

пересекаются в одной точке с координатами а = —К( и a/v = = (Км — Kf)/V. Точка пересечения должна быть расположена слева от оси ординат (a/v), причем положение ее относительно оси абсцисс (выше или ниже) зависит от того, больше или меньше параметр Км. величины

Уравнения (5.6) и (5.8) имеют тот же самый вид, что и уравнение Михаэлиса — Ментен. Иначе говоря, зависимости VKant или VKam/Ku,KayK от а представляют собой равнобочные гиперболы, проходящие через начало координат, и их можно анализировать точно таким же образом, как и зависимости от а или Ъ. Следовательно, уравнение (5.6) можно переписать следующим образом:

Ь *м , 1 . -=--1--• о.

^каж У У

Поэтому вторичный график зависимости b/VKam от Ъ является пря-

Типы механизмов ферментативного катализа

121

мой с наклоном, равным 1/V, и отрезком, отсекаемым на оси b/VKaa[, равным Km.IV. Аналогичным образом из уравнения (5.8) получаем

Рис. 5.5. Вторичные графики для механизмов с образованием тройного комплекса.

График зависимости b/VK3iK от b применим также для механизмов с замещением фермента.

Поэтому вторичный график зависимости ЪКм,кат№каж от b является прямой с наклоном, равным KmIV, и отрезком, отсекаемым на оси Ь^м.каж/^каж» равным Kf Км/V. Из этих вторичных графиков, представленных на рис. 5.5, можно легко рассчитать все четыре параметра уравнения (5.5): V, Kf, Km и Км.

Уравнение (5.7) графически также представляется равнобочной гиперболой, которая, однако, не проходит через начало координат, поскольку при Ъ 0 ЛГм.каж = • Эта гипербола определяется тремя параметрами и не может быть представлена в ли- ? нейной форме. Как и в других случаях, ЛГм.каж является менее удобным параметром, чем ^м.каж/^каж-

Если субстратом с варьируемой концентрацией является В, нужно строить первичные графики зависимости blv от Ъ при различных фиксированных значениях а. Анализируют эти зависимое-

122

Глава 5

ти так же, как и в предыдущем случае. Единственное существенное отличие здесь состоит в том, что в уравнение (5.5) не входит K.f; кроме того, всюду, где из простой замены А на В можно ожидать появления параметра л,-, следует вводить величину Л/ Лм'Ам*

Первичные и вторичные графики используются главным образом для предварительного анализа кинетических данных и их графического представления. При определении кинетических констант следует отдать предпочтение статистическим методам,' позволяющим проводить анализ всех экспериментальных данных одновременно. Эти методы рассмотрены в гл.10.

В случае механизма с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстратов для начальной скорости в отсутствие продукта реакции также выполняется уравнение (5.5), и поэтому только на основании измерения начальной скорости нельзя сделать вывод о том, каким является связывание субстратов — упорядоченным или неупорядоченным. Поскольку обсуждаемый механизм симметричен относительно А и В, величину К?К~м можно заменять на RfK^'- зти два произведения равны между собой. В том случае, когда справедливо допущение о равновесном связывании субстратов (т.е. когда скорость распада ЕАВ с образованием продуктов гораздо меньше, чем скорость других стадий, имеющих первый порядок по концентрации реагента), К? и /(^представляют собой константы диссоциации для комплексов ЕА и ЕВ соответственно, а Км и Км — две константы диссоциации для комплекса ЕАВ, соответствующие отщеплению А и В. Для графического анализа и для определения кинетических констант используются те же методы, что и в случае механизма с упорядоченным присоединением субстратов.

Для механизма с замещением фермента выражение для начальной скорости в отсутствие продукта имеет^следующий вид:

Vab

(5.9)

ККа + К*Ь + аЬ

Наиболее замечательная особенность этого уравнения состоит в отсутствии константы в знаменателе. (Эта особенность является общей для всех механизмов с замещением фермента, о которых говорилось в разд 3.7.) Первичные зависимости, получаемые при варьировании концентрации одного из субстратов, имеют для данного механизма отличительные особенности. Например, если в опыте варьируется а, то кажущиеся значения V и Км выражаются следующим образом:

Vb

V —

Км + Ь

Тицы механизмов ферментативного катализа

123

К

1л, каж

каж

к,

к, каж

Из этих параметров при изменении Ъ только один параметр — ^каж — меняется таким же образом, как и в случае механизмов с образованием тройного комплекса. Важным свойством механизма с замещением фермента является постоянство отношения ^каж^ , каж ; оно равно VI Км. У~Каж/Км.каж не меняется при изменении Ъ, однако в этом случае оно равно VIK^. Первичные графики зависимости alv от а или blv от Ъ представляют собой серии прямых, пересекающихся в одной точке, лежащей на оси alv или blv (рис.5.6). Таким образом, за исключением довольно редкого случая, когда /С* Единственным вторичным графиком, необходимым для анализа механизма с замещением фермента, является график за7 висимости blVKam от Ь, который имеет те же особенности, что

Рис