. 5.6. Первичные графики зависимости a/v от а при различных фиксированных значениях Ь для механизмов с замещением фермента. Предполагается, что ингибирование избыткои субстрата отсутствует. Зависимости blv от Ь при различных фиксированных ввачениях а имеют аналогичный вид.

124

Глава 5

и аналогичный график для механизмов с образованием тройных комплексов (рис.5.5).

Нетрудно понять, почему величина УКаж/Км,каж не зависит от концентрации того субстрата, концентрация которого в опыте не меняется. Достаточно вспомнить (см. разд.2.3), что величина VIKm представляет собой константу скорости псевдопервого порядка для ферментативной реакции при очень малых концентрациях субстрата. При скорость образования Е' становится настолько малой, что В реагирует с этой формой с такой скоростью, с какой она образуется (при условии, что концентрация самого реагента В не стремится к нулю). Поскольку в начальный момент времени стадии отщепления обоих субстратов можно рассматривать как необратимые, изменение концентрации В в этих условиях может не оказывать никакого влияния на скорость полной реакции. Иными словами, величина Уках/Км.,каж не должна зависеть от Ъ. По тем же соображениям в опытах, когда варьируется Ь, величина Укаж/ЛГм.каж не должна зависеть от а. Напротив, в механизме с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов две стадии связывания субстратов не отделены друг от друга необратимой стадией. Поэтому, какой бы малой ни была а, скорость стадии ЕА + ЕАВ по-прежнему будет зависеть от Ъ, и какой бы малой ни была Ъ, скорость этой стадии продолжает зависеть от концентрации комплекса ЕА, которая в свою очередь зависит от а. Аналогичные рассуждения применимы к механизму с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстратов.

5.6. Ингибирование избытком субстрата

Выводы, к которым мы пришли в предыдущем разделе, строго говоря, справедливы только при малых концентрациях субстрата, поскольку для всех реальных механизмов двухсубстратных ферментативных реакций по меньшей мере один из четырех реагентов может присоединяться к «ошибочным» формам фермента. В механизме с замещением фермента субстрат и продукт, в которых отсутствует переносимая группа, обычно присоединяются к «ошибочной» форме свободного фермента. В механизме с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстратов субстрат и продукт присоединяются к «ошибочному» двойному комплексу. В механизме с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов к «ошибочному» двойному комплексу присоединяются либо второй субстрат, либо первый продукт, и субстратное ингибирование может наблюдаться либо для прямой, либо для обратной реакции (но не для обоих направлений), потому что только один из двух двойных комплексов может выступать в роли «ошибочного».

Типы механизмов ферментативного катализа

125

Для удобства примем, что в каждом механизме субстратом, являющимся в больших концентрациях ингибитором, является реагент В. Однако полученные результаты легко можно будет распространить и на другие реагенты.

В разд. 3.7 при обсуждении механизма с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов рассматривался непродуктивный комплекс EBQ. Для его учета каждый член для EQ в уравнении скорости нужно умножить на (1 -f- k+s Ь/к_5), где fcV^+s — константа диссоциации комплекса EBQ. Уравнение (5.5) примет поэтому следующий вид:

Vab

К?К& + Я&а + К*Ь+аЪ(±+ Ъ/К* ) ' (5-10)

причем параметр К& не равен отношению &_s/A:+5, поскольку член, включающий ab, относится к комплексу EQ только частично. В зависимости от соотношения между (ЕАВ—EPQ) и EQ в стационарном состоянии параметр К& становится либо близким к отношению к_5/к^, либо заметно больше его. Таким образом, для обсуждаемого механизма субстратное ингибирование ни при каких разумных концентрациях реагента В выявить не удается.

Субстратное ингибирование, описываемое уравнением (5.10), эффективно только при высоких концентрациях реагента А и, следовательно, относится к бесконкурентному типу. Первичные зависимости blv от Ъ представляют собой параболы и пересекаются в точке Ъ = —Kf KmIKm.- Первичные зависимости alv от а являются линейными, однако не имеют общей точки пересечения; эти зависимости представлены на рис.5.7.

Для механизма с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстратов при условии достаточно быстрого установления равновесия концентрация комплекса EQ в отсутствие Q равна нулю. Поскольку субстрат В не может связываться с формой, которая отсутствует, для обсуждаемого механизма субстратное ингибирование не обнаруживается до тех пор, пока не добавлен продукт Q. Если же допущение о быстро устанавливающемся равновесии не выполняется, то нет никаких оснований полагать, что субстратное ингибирование будет отсутствовать. Однако с уверенностью сказать, каков будет характер субстратного ингибирования, довольно трудно, поскольку уравнение скорости имеет весьма сложный вид. Комплекс EBQ в этой ситуации не является «тупиковым» (хотя некоторые исследователи свободно пользуются этим термином), потому что он может образоваться либо из ЕВ, либо из EQ и не должен обязательно находиться в равновесии с тем или иным двойным комплексом.

126 Глава 5

В механизме с замещением фермента в результате связывания В с Е образуется непродуктивный комплекс ЕВ. Комплекс ЕВ является «тупиковым», и поэтому [ЕВ ]/ [Е ] = ЫК.% где Kfi — константа диссоциации этого комплекса. Уравнение (5.9) принимает поэтому следующий вид:

Vab

Рис. 5.7. Влияние ингибирования избытком субстрата В (при Kf{ = ЮКМ) на первичные зависимости для механизмов с образованием тройного комплекса

(сравните с рис. 5.4).

В соответствии с этим уравнением субстратное ингибирование наиболее эффективно при малых значениях а и, следовательно, относится к' бесконкурентному типу. Первичные зависимости b/v от Ъ графически снова представляются параболами, однако пересекаются они при Ъ = 0, т.е. точка пересечения лежит на оси b/v. Первичные зависимости a/v от а линейны, причем не имеют общей точки пересечения, однако каждая пара прямых пересекается при положительных значениях а. Эти зависимости представлены на рис. 5.8.

На первый взгляд может показаться, что субстратное ингибирование серьезно усложняет анализ кинетических данных. На

Типы механизмов ферментативного катализа 127

само* деле оно очень информативно, так как позволяет обнаружить различие между механизмом, включающим образование тройного комплекса, и механизмом с замещением фермента. Кроме того, интерпретация данных по субстратному ингибированию обычно не представляет трудностей. Поскольку субстраты, как правило, обладают большим сродством к «правильным» формам

а Ъ

Рис. 5.8. Влияние ингибирования избытком субстрата В (при К§ = 10 гГу^) на первичные зависимости для механизмов с замещением фермента (сравните

с рис. 5.6).

фермента, чем к «ошибочным», субстратное ингибирование очень редко бывает настолько сильным, чтобы при низких концентрациях субстрата повлиять на анализ стационарных скоростей ферментативных реакций (разд.5.5). Конкурентный характер субстратного ингибирования является убедительным доказательством подчинения реакции механизму с замещением фермента. Напротив, тот факт, что точка пересечения первичных зависимостей лежит на оси alv или blv, свидетельствует о невыполнимости этого механизма, поскольку он отражает особый случай образования тройного комплекса. Наконец, для механизма с образованием тройного комплекса и упорядоченным присоединением, субстратов субстратное ингибирование позволяет идентифици-

128 Глава 5

ровать второй субстрат; в отсутствие субстратного ингибирования для решения этой задачи потребовалось бы проведение /экспериментов по ингибированию продуктами реакции.

5.7. Обратимая реакция

Если можно изучить не только прямую, но и обратную ферментативную реакцию, то обычно имеет смысл провести такие исследования, поскольку они позволяют подтвердить и дополнить данные о механизме реакции, полученные из опытов по изучению прямой реакции. Для каждого из рассмотренных механизмов переноса групп обратная реакция полностью аналогична прямой. Например, опуская в полном уравнении скорости для механизма с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов [в уравнении (5.2)] члены, "содержащие а и Ъ, получаем

__— УгРЯ_ _

Это уравнение можно сопоставить с уравнением (5.5) для прямой реакции. Знак минус означает, что уравнение относится к обратной реакции; если нет необходимости анализировать полное уравнение, содержащее концентрации всех четырех реагентов, его можно опустить.

Как и в случае односубстратных-однопродуктных реакций (разд.2.6), кинетические константы для прямого и обратного направлений мультисубстратной реакции связаны с константой равновесия К. соотношениями Холдейна. Для любого механизма скорость реакции в равновесии должна быть равна нулю; на практике это означает, что должен быть равен нулю числитель в выражении для скорости реакции. Поэтому для уравнения (5.2) имеем

Vfaac Ьас yrfoogoo=0

КАКК кь\к?

т. е.

Роо Я,

к = = * (5.13)

«со*оо VrK?K*

где «оо, ЬооИ т.д. — это значения концентраций при оо, т.е. в равновесии.

Второе соотношение Холдейна можно получить путем преобразований выражений для кинетических параметров, приве-

Типы механизмов ферментативного катализа 129

денных в табл.5.1:

K_(vf\a <*g

\vr) кмк}

(5.14)

Справедливость уравнения (5.13) не зависит от того, какой смысл имеют кинетические параметры, и поэтому это уравнение, очевидно, справедливо для любого механизма, описываемого уравнением (5.2), т.е. для механизмов, включающих изомеризацию ЕА, ЕАВ или EQ. Удивительно, пожалуй, то, что уравнение (5.14) также носит общий характер и поэтому применимо к механизмам, включающим изомеризацию. Это совсем не очевидно и нелегко доказать, однако сделанное утверждение верно и следует из того, что в условиях, когда полная реакция достигает равновесия, не только полная скорость реакции равна нулю,