но и каждая индивидуальная стадия также является равновесной. Для каждого механизма всегда можно получить одно соотношение Холдейна, воспользовавшись тем, что скорость реакции в равновесии равна нулю, а также приняв во внимание дополнительные соотношения, обычно вытекающие из рассмотрения кинетических параметров, выраженных через константы скорости. Например, для механизма с замещением фермента имеем

к= KfKf VfKfs& vfKMK? ( vf у

KfKf VrKfK* VrKMKf \vr I KAKB

Аналогичные соотношения имеют место и для других механизмов. Хотя в принципе соотношения Холдейна можно использовать Для дифференциации механизмов ферментативных реакций, на практике этот подход не всегда оказывается самым лучшим, поскольку обычно измерить кинетические константы с такой точностью, чтобы дать однозначный ответ, не удается. Целесообразнее использовать уравнения Холдейна для проверки внутренней согласованности результатов, полученных другими методами. Если эксперимент позволяет рассчитать все кинетические параметры, то проверить выполнимость соотношений Холдейна не составляет труда, и каждую серию экспериментов рекомендуется всегда заканчивать именно такой проверкой.

Параметры уравнения скорости могут быть связаны рядом дополнительных соотношений, которые бывают иногда весьма полезными для выявления изомеризации промежуточных соединений. Другие подходы, основанные на измерении стационарных скоростей, не позволяют сделать этого. Введение стадий изомеризации промежуточных соединений не влияет на вид уравнения скорости (разд.3.7), однако может приводить к невыполнимости соотношений, связывающих определенные кинетические парамет-

I30 Глава 5

ры. Например, если в механизме с образованием тройного/комплекса и упорядоченным присоединением субстратов отсутствуют стадии изомеризации, то, преобразуя выражения для кинетических параметров, приведенные в табл.5.1, можно получить следующее соотношение:

= 1 +

Поскольку как константа k_t, так и константа к_2 должны быть положительными, справедливо следующее неравенство:

> 1. (5.15)

Аналогичным образом получаем

VrK?

> 1. (5.16)

В отличие от соотношений Холдейна выполнимость неравенств (5.15) и (5.16) зависит от того, какой смысл имеют кинетические параметры, и эти соотношения для механизмов, включающих стадии изомеризации, выполняются не всегда: если способна к изомеризации форма ЕА, то перестает выполняться соотношение (5.15); если изомеризуется форма EQ, то неприменимым оказывается соотношение (5.16). Следовательно, тот факт, что экспериментально определенные значения кинетических параметров не удовлетворяют соотношениям (5.15) или (5.16), указывает на изомеризацию форм ЕА или EQ. Однако обратное утверждение неверно, т.е. выполнимость соотношений (5.15) или (5.16) не означает, что стадии изомеризации ЕА или EQ отсутствуют. Кроме того, подобный подход не позволяет выяснить, сколько стадий имеет изомеризация промежуточного соединения, и обнаружить изомеризацию самого тройного комплекса. (Для получения подобной информации необходимо провести исследования переходной фазы реакции; этот вопрос рассмотрен в гл.9). Тем не менее описанный подход был использован для доказательства существования стадий изомеризации в случае фосфатазы картофеля [79] и ряда других ферментов.

5.8. Ингибирование продуктом реакции

Среди всех существующих методов установления механизмов ферментативных реакций к числу наиболее полезных и простых относится метод изучения ингибирования продуктами реакции.

Типы механизмов ферментативного катализа 131

В том случае, когда в реакционную смесь добавляется только один Продукт, член, соответствующий обратной реакции в уравнении скорости, равен нулю (за исключением редко Встречающихся односубстратных реакций, которые обсуждаются в разд.5.10). Единственный эффект, который оказывает введение продукта реакции, состоит поэтому в том, что оно приводит к увеличению знаменателя в уравнении скорости и, следовательно, к торможению реакции. На вопрос о том, в какой роли будет выступать ингибитор — как конкурентный, бесконкурентный или смешанный,— готового ответа не существует. Характер ингибирующего действия продукта реакции зависит от того, концентрация какого субстрата меняется в опыте. Однако если вопрос о выборе субстрата с варьируемой концентрацией решен, то анализ ингибирования продуктом становится очень простым. Знаменатель каждого уравнения скорости разбивают на «варьируемые» и «постоянные» члены; первые содержат субстрат с" варьируемой концентрацией, а вторые — нет. Как было показано в разд.5.5, VKam зависит от «варьируемых» членов, в то время как Укаж/Ам.каж— от «постоянных». Поэтому (если мы вспомним, что говорилось о типах ингибиторов в гл.4) продукт выступает в роли конкурентного ингибитора в том случае, когда его концентрация входит только в постоянные члены, в роли бесконкурентного ингибитора — когда его концентрация входит только в «варьируемые» члены, и в роли смешанного ингибитора — когда концентрация продукта входит в оба члена. Если продукт может присоединяться только к одной из форм фермента, то в уравнение скорости входят члены, содержащие концентрацию продукта только в первой степени, и поэтому ингибирование будет линейным. Однако в том случае, когда продукт связывается также с «ошибочными» формами фермента и образуются «тупиковые» комплексы, возможно нелинейное ингибирование.

Приложение этих принципов анализа ингибирования продуктом реакции к механизму с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов [уравнение (5.2) 1 показывает, что Р является смешанным ингибитором независимо от того, коцентрация какого субстрата (А или В) меняется в опыте, потому что для обоих субстратов член, содержащий Р, является «постоянным», а член, содержащий аЪр, — «варьируемым». В то же время д входит в виде сомножителя в произведение bxq, произведение же а x q отсутствует, и поэтому Q выступает в роли конкурентного ингибитора, когда в опыте варьируется концентрация А, и в роли смешанного — когда варьируется концентрация В. Дополнительные данные можно получить, рассмотрев обратную реакцию: А является смешанным ингибитором по отношению к Р, но конкурентным по отношению к Q, в то время как В является смешанным ингибитором по отношению как к Р, так и к

132

Глава 5

Q. Все эти ингибиторы являются линейными, если образованием «тупикового» комплекса EBQ можно пренебречь. Для механизма с образованием этого комплекса в уравнении скорости появляются члены, содержащие Ь2д и ab2 (см. разд. 3.3 и 3.7), в результате чего ингибирование обратной реакции реагентом В становится нелинейным.

В том случае, когда субстрат, концентрация которого остается в опыте постоянной, используется в насыщающей концентрации, определенные типы ингибирования продуктом реакции исчезают. Например, если насыщающей является концентрация А, то члены уравнения (5.2), которые не содержат а, становятся несущественными, и q исчезает из уравнения скорости. Поэтому Q перестает быть ингибитором, когда варьируется Ь. В то же время р как в «постоянном», так и в «варьируемом» членах знаменателя сохраняется, и поэтому тип ингибирования, оказываемого Р, остается прежним. Напротив, если насыщающей является концентрация Вив опыте варьируется а, то Р становится бесконкурентным ингибитором, в то время как Q остается конкурентным ингибитором.

Нетрудно предсказать далее характер ингибирования продуктом реакции для любого другого механизма. Поскольку для анализа остальных двухсубстратных-двухпродуктных механизмов не требуется ничего принципиально нового, мы предлагаем читателю в качестве упражнения провести подобный анализ самостоятельно. Наиболее надежные данные об ингибировании продуктом реакции удается получить, анализируя уравнение скорости, однако те же результаты может дать исследование механизма реакции без вывода уравнения. Конкурентное ингибирование возникает в одном из двух случаев: во-первых, когда ингибитор присоединяется к тем же формам, что и субстрат с варьируемой концентрацией, причем связывание одного лиганда исключает связывание другого, и, во-вторых, когда ингибитор, связываясь, вытесняет субстрат с варьируемой концентрацией (как это имеет место, например, в механизме Теорелла—Чанса). Обе ситуации означают, что связывание ингибитора препятствует связыванию субстрата, и приводят к одинаковому изменению уравнения скорости. Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда отсутствуют обратимые пути между стадиями связывания субстрата и связывания продукта. Для двух-продуктных механизмов бесконкурентное ингибирование в основном ограничивается уже рассмотренным случаем: ингибирование первым продуктом для механизма с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстрата при насыщающей концентрации второго субстрата. Однако для реакций с тремя и большим числом продуктов бесконкурентное ингибирование встречается чаще, а, например, для механизмов с упо-

Типы механизмов ферментативного катализа

133

рядоченным присоединением субстратов наблюдается неизменно по крайней мере для одного продукта. Рассмотрим следующий механизм:

Если присутствует только один продукт, то стадии, в которых высвобождаются другие продукты, являются необратимыми, поэтому Q выступает в роли бесконкурентного ингибитора при использовании в качестве субстрата с варьируемой концентрацией либо А, либо В; R является бесконкурентным ингибитором по отношению к С; однако Р не является бесконкурентным ингибитором ни для какого субстрата. В то же время Р при насыщающей концентрации В становится бесконкурентным ингибитором по отношению к А, потому что связывание В формой ЕА принимает необратимый характер.

Если полная реакция в эксперименте является обратимой, то механизм ее не может содержать никаких необратимых по своей природе стадий. Однако в двух упомянутых случаях отдельные стадии могут стать необратимыми: либо когда концентрация субстрата является насыщающей, либо когда отсутствует продукт реакции. К этому утверждению следует подходить с известной осторожностью