. Насыщающая концентрация — это концентрация, которая приближается к бесконечности, а не просто высокая концентрация, и, чтобы сделать определенную стадию необратимой, может понадобиться концентрация, существенно превышающая достижимую экспериментально. С такой же осторожностью следует подходить к условию отсутствия продукта. В некоторых случаях, особенно если изучается реакция, направление которой термодинамически невыгодно, продукт реакции может быть настолько сильным ингибитором, что его действие

становится заметным с самого начала реакции. Хорошим примером

подобной ситуации может служить фумараза: Альберти и др.

[6 ] обнаружили, что для получения более или менее надежных значений начальной скорости следует использовать начальные

участки кинетических кривых с глубиной реакции, не превышаю-

134 Глава 5

щей нескольких процентов. При этом следует применять также низкие концентрации субстрата как для прямой, так и для обратной реакции.

5.9. Изотопный обмен

Изучение начальных скоростей многосубстратных реакций в обоих направлениях, проводимое в присутствии и в отсутствие продуктов реакции, обычно позволяет исключить многие возможные типы механизмов и выяснить основные свойства механизма изучаемой реакции. Однако этот подход, как правило, не дает никакой информации о второстепенных путях реакции, которые вносят настолько малый вклад в общую скорость, что обнаружить их практически невозможно. Поэтому для окончательного решения вопроса о механизме реакции требуется дополнительная информация. Даже в том случае, когда результаты исследования начальных скоростей и ингибирования продуктом ясно указывают на определенный механизм, справедливость вывода целесообразно подтвердить независимым путем. Зачастую при этом весьма полезным оказывается метод изотопного обмена, который был введен в ферментативную кинетику Бойером [17 ].

Применяя метод изотопного обмена в ферментативной кинетике, делают два важных допущения. Эти допущения, как правило, выполняются, и часто их выполнимость просто подразумевается, однако во избежание недоразумений целесообразно еще раз четко сформулировать их. Первое допущение состоит в том, что-реакция, протекающая с участием радиоактивных субстратов, имеет тот же механизм, что и нормальная реакция, и характеризуется теми же константами скорости. Иными словами, предполагается, что изотопные эффекты пренебрежимо малы. Это допущение в большинстве случаев выполняется, если радиоактивным атомом не является тритий. Однако если атом трития не участвует непосредственно в реакции и в связывании субстрата ферментом, то и в этом случае изотопными эффектами можно, по-видимому, пренебречь. Второе допущение состоит в том, что концентрации всех радиоактивных форм пренебрежимо малы по сравнению с концентрациями немеченых форм. Это допущение очень важно, поскольку оно позволяет существенно упростить анализ данных, обеспечить же его выполнимость не составляет труда.

Принципиальную основу метода изотопного обмена проще всего понять, рассмотрев в качестве примера перенос радиоактивного атома (обозначенного звездочкой) от А* к Р* в механизме с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов:

Типы механизмов ферментативного катализа

135

ЕА*В EP*Q

Поскольку обмен протекает через, стадию связывания А* формой Е, он может иметь место только при значительных концентра-диях Е. Ясно поэтому, что при высоких концентрациях А или Q обменная реакция будет тормозиться, так как соединения конкурируют с А* за Е. Зависимость обменной реакции от концентраций В и Р носит более сложный характер. С одной стороны, обменная реакция протекает через стадию связывания В формой ЕА*, и, чтобы мог идти обмен, вещество В должно присутствовать в конечной концентрации. С другой стороны, если концентрации В и Р очень велики, фермент будет находиться преимущественно в форме (ЕАВ—EPQ), и поэтому форма Е, к которой может присоединяться А*, будет практически отсутствовать. Можно ожидать поэтому, что высокие концентрации В и Р будут тормозить обмен; нетрудно показать, что это действительно так. Запишем выражения для скоростей изменения концентраций меченых промежуточных соединений и в соответствии с допущением о стационарном протекании процесса приравняем их к нулю:

dt

- [ЕА*] = [Е] а* - (k_t + к+ф) [ЕА*] + к_2 [ЕА*В] = О,

dt

¦ [ЕА*В] = к+ф [ЕА*] - (к_2 + *+3) [ЕА*В] + к_3 р* [EQ] = 0.

Подставляя р* = 0 и решая систему уравнений относительно IEA*B 1, получаем

[ЕА*В] =

Кх [El a*b

Начальная скорость обмена v* равна к+3 [ЕА*В ], следовательно,

_ fc+i fc+a Кз [Е] а*ъ /с . г,.

136

Глава 5

Чтобы пользоваться этим уравнением, необходимо знать величину [Е ]. Эта задача не представляет особых трудностей, если предварительно определены кинетические константы для реакции с немечеными субстратами. Проще всего (и это самый распространенный подход) изучать изотопный обмен в условиях, когда немеченые реагенты находятся в равновесии. В этом случае [Е ] задается следующим соотношением:

[Е] =-Ь.-. (5.18)

1 к+1а ^ fc+1 fc+2 аЪ ^_ fc-4g fc-l fc_l fc-2 А+4

Подставляя выражение для [Е ] в уравнение (5.17), получаем

у*___fc+i fc+2 fc+з е0а*Ь_

(к. л a k.ik.uab к «д\ 1 + -Т-+ , ь + ~^~ И*-* (fc-2 + fc+3) + fc+2 fc+3"J гС—i 1 К—g ^+-1 /

Если в ходе реакции поддерживается равновесие, в выражение для V* будут входить только три концентрации из четырех, какие именно — зависит от нашего выбора. Уравнение (5.19) содержит а, Ъ и q, но не содержит р. Любую из трех концентраций (а, Ь или q) можно выразить через р, используя равенство

д- __ fc+1 к+2 fc+з fc+4 _ PQ

fc-l fc_2 fc-3 fc-4 °b

Пусть b и p изменяются таким образом, что их отношение остается постоянным (чтобы не нарушать равновесия), а значения а и q не меняются. Нетрудно видеть, как будет меняться при этом скорость изотопного обмена; для этого отметим, что знаменатель уравнения (5.19) является квадратичным относительно Ь, а числитель прямо пропорционален Ъ. Следовательно, уравнение (5.19) имеет такой же вид, что и уравнение для простого субстратного ингибирования (разд.4.9). Поэтому при изменении а и Ь от нуля до насыщающих значений скорость обмена возрастает, достигает максимума и снижается до нуля.

Аналогичным образом можно вывести уравнения скорости для любой другой реакции обмена. Концентрации немеченых реагентов следует поддерживать равновесными (задача более простая, чем измерения стационарных скоростей), потому что уравнения для равновесных условий намного проще уравнений для стационарного состояния.. Если в рассмотренном выше примере условия равновесия не выполняются, то уравнение (5.18) должно быть заменено соответствующим выражением для стационарной области реакции, т. е. уравнением (3.3), которое является гораздо более сложным.

В механизме с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов переход радиоактивной метки

Типы механизмов ферментативного катализа

137

от В* к Р* или Q* не подавляется А, потому что при насыщающих концентрациях А форма ЕА не исчезает, а, напротив, ее концентрация растет. Сходные результаты получаются для обратной реакции: перенос радиоактивной метки от Q* подавляется избытком Р, а перенос от Р* не подавляется избытком Q.

Механизм с неупорядоченным присоединением субстратов отличается от механизма с упорядоченным присоединением тем, что ни одна из обменных реакций не подавляется избытком альтернативного субстрата полностью. Например, если В присутствует в избытке, то А* не может связаться формой Е, а вместо этого присоединяется к ЕВ с образованием комплекса ЕА*В, который может распадаться, давая Р* или Q*. Поскольку радиоактивность определяется с очень высокой чувствительностью, метод изотопного обмена позволяет обнаружить второстепенные альтернативные пути реакции. Следует, однако, оговориться, что для получения методом изотопного обмена достаточно надежных результатов необходимы гораздо более очищенные препараты ферментов, чем при обычных кинетических измерениях. Причина этого очень проста. Допустим, что мы изучаем алкогольдегидро-геназу, которая катализирует реакцию

Этанол + НАД+ Ацетальдегид + НАД • Н.

Если изучается полная реакция, .присутствие небольших количеств балластных ферментов не имеет существенного значения, поскольку маловероятно, чтобы какая-либо из примесей'-была катализатором полной реакции. Однако, когда рассматривают обмен между НАД+ и НАД-И, ситуация меняется: число ферментов, которые способны катализировать этот обмен, достаточно велико. Поэтому для того, чтобы получить надежные сведения об алкогольдегидрогеназе, нужно быть уверенным в том, что в препарате отсутствуют ферменты, катализирующие обмен между НАД+ и НАД-Н.

Метод изотопного обмена позволяет упростить анализ ферментативной реакции, подчиняющейся механизму с замещением фермента, поскольку в этом случае можно изучать только половину реакции:

138

Глава S

Этот механизм имеет такой же вид, что и полный механизм (он включает Р* и А* вместо В и Q соответственно), однако характеризуется более простыми кинетическими свойствами, потому что константы скорости для обеих половин реакции одинаковы. Описанное свойство механизма с замещением фермента представляет собой его важное качественное отличие от механизмов с образованием тройного комплекса, поскольку для последних обмен отсутствует, пока ферментная система является неполной. Подобный метод дифференциации двух типов механизмов ферментативных реакций использовался и обсуждался в работах {45, 94 ] еще до применения метода изотопного обмена как кинетического метода.

То обстоятельство, что изотопный метод позволяет изучать не механизмы в целом, а отдельные их части, особенно полезно при исследовании сложных механизмов с замещением фермента, включающих три или большее число субстратов. В подобных Случаях любое упрощение кинетики действия фермента особенно желательно и дает хорошие результаты; подобный подход был довольно успешно использован Сидером и Шварцем [26 ] при изучении аспарагин-синтет