азы.

5.10. Индуцированный перенос

Совершенно иной вариант использования метода изотопного обмена, известный как индуцированный перенос, был разработан Бриттоном [19, 20]. Он особенно полезен с точки зрения идентификации стадий изомеризации фермента в однопродуктных реакциях. Односубстратиые-однопродуктные реакции во многих отношениях значительно проще мультисубстратных, однако при их изучении возникает одно существенное осложнение, обусловленное тем, что не удается проанализировать характер ингибирования продуктом, исключив обратную реакцию. Это обстоятельство очень затрудняет однозначную идентификацию стадий изомеризации фермента. Далее, сама природа односубстратных-однопродуктных реакций, которые непременно должны представлять собой реакции изомеризации, обусловливает возможность появления стадий изомеризации фермента. Рассмотрим, например, фермент, катализирующий взаимное превращение глюкозо-1-фосфата (GP) и глюкозо-6-фосфата (PG), и допустим для простоты, что он представляет собой фоефофермент Е, который в результате реакции превращается в другую форму фосфофермента, Е', причем механизм содержит еще одну (третью) стадию — стадию обратной изомеризации Е' в Е. Полный механизм может быть представлен следующей схемой:

Типы механизмов ферментативного катализа

139

PG Р

t_i_I

GP *--з^" PG

Схема! Р

Е . Е'

Этот механизм учитывает одну (и, конечно, не единственную) возможность изомеризации фермента. Вторая возможность следует из того экспериментального факта, что фосфоглюкомутаза из скелетных мышц кролика требует для проявления каталитических свойств присутствия каталитических количеств глюкозо-1,6-ди-фосфата (PGP). Эту возможность можно учесть в схеме 1, если допустить, что PGP нужен для превращения дефосфорилиро-ванной формы фермента в активную форму. Еще одна возможность изомеризации фермента изображена на следующей схеме:

GP„

G Р

PGP

Схема 2

Mil-1 ' i i i i

Mill PGP

Здесь реакция протекает через образование тройного комплекса, причем PGP выступает одновременно в роли второго субстрата и первого продукта.

Возможны и другие механизмы односубстратных-однопро-дуктных реакций, но для иллюстрации достаточно обсудить два из них, приведенные выше. Отметим, что схема 1 в отличие от схемы 2 содержит стадию изомеризации фермента. Поэтому эти два механизма можно легко разграничить в опытах по ингибированию продуктом: если выполняется схема 1, то PG и GP должны быть смешанными ингибиторами; если выполняется схема 2, то PG и GP — зто конкурентные по отношению друг к другу ингибиторы. В соответствии с этим Рэй и Росцелли [127], изучив реакцию, катализируемую фосфоглюкомутазой из скелетных мышц кролика, нашли, что ингибирование обоими фосфатами глюкозы носит чисто конкурентный характер, без всякой «примеси» не^ конкурентной составляющей. Они пришли к заключению, что в данном случае стадия изомеризации либо отсутствует, либо протекает так быстро, что формы Е и Е' можно рассматривать как единую форму. Тем не менее Бриттон и Кларк [21 ], проведя серию элегантных экспериментов (см. ниже), сумели однозначно показать, что для этого фермента выполняется схема 1. "

Бриттон и Кларк изучали действие фосфоглюкомутазы, изме-

140

Глава 5

ряя обмен радиоактивной метки между GP и PG, однако их подход отличался от обычного следующим важным обстоятельством. Эти исследователи сначала дожидались установления равновесия между мечеными соединениями, а затем добавляли в большом избытке немеченый реагент (либо GP, либо PG) и наблюдали за удалением реакции с мечеными реагентами от исходного равновесия. Может показаться, что подобное направление реакции с мечеными реагентами противоречит законам термодинамики, однако оно возможно благодаря диссипации большого количества свободной энергии в реакции с немечеными реагентами. Используя 14С-меченые реагенты (G*P и PG*), Бриттон и Кларк нашли, что реакция с мечеными соединениями протекает в обратном направлении по отношению к реакции с немечеными соединениями. Этот результат легко объясняется схемой 1: для того чтобы превратиться в PG*, GP* должен связаться первоначально с формой Е; однако в присутствии больших количеств GP концентрация Е пренебрежимо мала. В то же время, даже если константы /с_3и/с+3 имеют высокие значения, небольшое количество формы Е' всегда сможет связаться PG*. Таким образом, отсутствие формы Е препятствует протеканию реакции G*P —»- PG*, а протеканию обратной реакции, PG*-*-G*P, благоприятствует присутствие Е'. Для ситуации, в которой в начальный момент времени между G*P и PG* существует равновесие, рассмотрим еще один путь, когда ферментативная реакция"

Е + G*P =рь Е' + PG*

из-за нарушения баланса между Е и Е', вызванного сильным потоком немеченых реагентов, находится вдали от равновесия. Здесь быстрое превращение GP в PG должно сопровождаться медленным превращением PG* и G*P. Напротив, в присутствии большого избытка PG должна протекать медленная реакция превращения G*P в PG*. В схеме 2 для 14С-обмена требуется участие немеченых реагентов:

g р g*p pgp^—- » g*p^гср

pg*p gp * р g р g*p

i_j_i_i_j

pgp pg рь p g pg*p

i_' ' '_i ¦_i__i

В присутствии большого избытка GP все стадии в правом цикле направлены только по часовой стрелке, в то время как в левом цикле— только против. Таким образом, перенос метки от G*P к PG* возможен, а обратный перенос — нет. Следовательно, если ферментативная реакция следует схеме 2, то перенос метки дол-

Типы механизмов ферментативного катализа

141

жен происходить в направлении, совпадающем с направлением реакции с немечеными реагентами, что противоречит экспериментальным данным. Бриттон и Кларк подтвердили выполнимость механизма, описываемого схемой 1, используя также 32Р-меченые реагенты, GP* и P*G. Они нашли, что перенос происходит очень медленно, причем в том же направлении, что и реакция с немечеными реагентами. В случае схемы 1 перенос метки в фосфатной группе требует протекания реакции из 6 стадий, включающей образование в качестве промежуточного соединения 3 ^-меченого фермента:

GP* PG

Р . Ч_„ Р G F*_У Р*

I_I_I *~ I—I—I |—I—1

Р Л_. Р* G Р ._^ Р*

I—I—I •* f *- I—I—I ^ i—i—i

P*G GP

В этой схеме должен высвобождаться немеченый PG и связываться немеченый GP (движение по часовой стрелке). Избыток GP облегчает протекание обеих реакций, но тормозит обратные реакции. Таким образом, из-за отсутствия свободного фермента перенос метки от GP* к P*G возможен, хотя и протекает в неблагоприятных условиях, в то время как обратная реакция невозможна. Поэтому перенос 32Р-метки должен протекать с низкой скоростью, причем в направлении, соответствующем направлению реакции с немечеными реагентами, как и наблюдалось в опыте.

В схеме 2 перенос 32Р-атома должен осуществляться по сложному механизму, включающему три цикла. Анализ этого механизма приводит к такому же качественному выводу: перенос должен протекать в направлении, соответствующем протеканию реакции с немечеными реагентами. Однако кинетические свойства обсуждаемых двух схем различны, и Бриттон и Кларк показали, что их экспериментальные данные согласуются только со схемой 1.

Не желая слишком усложнять материал, мы рассмотрели процесс индуцированного переноса чисто качественно, но используя подходы, аналогичные тем, которые применялись при анализе обычного изотопного обмена, можно без труда получить соответствующие кинетические уравнения. Метод индуцированного переноса пока не получил широкого распространения, однако рассмотренный нами пример с фосфоглюкомутазой ясно показывает, насколько ценным он может быть для выяснения тех особенностей механизма ферментативных реакций, которые не обнаруживаются в экспериментах по ингибированию продуктом реакции.

Глава 6

Влияние рН и температуры на ферменты

6.1. рН и ферментативная кинетика

Главный недостаток, которым страдали ранние работы по ферментативной кинетике, состоял в том, что в них не придавали значения влиянию на ферментативный катализ Н+-ионов. В водных растворах концентрация Н+-ионов может меняться от 1 М до приблизительно 10~14 М. Этот огромный интервал обычно сжимают до разумных размеров введением логарифмической шкалы: рН = —lg[H+]. Свойства всех ферментов очень сильно зависят от рН, и механизм их действия невозможно понять, если не ввести как непременное условие проведения любого серьезного исследования контроль рН, что и было сделано Михаэлисом и его сотрудниками. На самом деле первый шаг в этом направлении сделал несколькими годами ранее Сервисен 1134], который ввел представление о шкале рН и описал использование буферных растворов в своей классической работе, показавшей, насколько важна концентрация водородных ионов в исследованиях ферментов. Несмотря на разногласия при интерпретации рН-эффектов в ферментативной кинетике, совершенно ясно, что любая попытка йровести кинетическое исследование без соответствующего контроля рН бессмысленна.

Удивительным, пожалуй, является тот факт, что такое полезное для многих областей науки понятие, как рН, ввел энзимолог. Поэтому целесообразно обсудить те свойства ферментов, которые способствовали введению понятия рН в энзимологии до того, как это понадобилось сделать в гораздо более развитой области науки — в химической кинетике. За немногими исключениями (к числу которых относятся, например, пепсин и щелочная фос-фатаза), наиболее изученные ферменты активны только в водном растворе при значениях рН в интервале от 5 до 9. На самом деле физиологически важную активность вне этого интервала обнаруживает только пепсин. Для области рН 5—9 значения концентраций водородных и гидроксильных ионов лежат в интервале от 10"9 до 10 5М, т. е. весьма малы, и поэтому концентрации этих ионов очень чувствительны к примесям. Экстракты целых клеток и неочищенные препараты ферментов, как правило, обладают достаточной буферной емкостью из-за присутствия в них посторонних ферментов и других полиэлектролитов, однако в ходе очистки фермента зти соединения удаляются, так что при работе

Влияние рН и температуры на ферменты

143

с